植物的垂直抗病性不仅取决于植物本身的基因,还取决于病原体的基因型。在通常多数情况下,需要植物具有水平抗病性,即植物对病原菌具有广谱抗病性,这样能够有效抵御植物病原物的入侵。防御素是低分子短肽中的一个家族,是生物体在防御反应过程中产生的细胞毒性小肽,它对细菌、真菌及其病毒等均有不同程度的抗性。在生物界中分离到的防御素已达300多种,其中以兔防御素的抗性谱最广,利用转基因技术将兔防御素基因NP-1导入黄瓜,提高其抗病原菌病害的研究,目前在国内外尚未见报道。　　黄瓜在我国蔬菜周年供应上占有重要地位,但容易受到各类真菌病害的危害而使产量降低,品质下降。目前采用常见的化学防治手段虽然取得了一定的功效,但是带来了严重的环境污染、生态失调和危害人类健康等弊端。传统的育种途径周期长,效率低,且黄瓜具有严重的有性杂交不亲和障碍,故传统的育种方法也很难得到具有抗性的优良品种。随着分子生物学和基因克隆技术的迅速发展,利用基因工程手段进行抗病分子育种已成为流行趋势。本课题以津研四号黄瓜子叶为外植体,利用农杆菌介导法将兔防御素基因 NP-1导入黄瓜,建立了高效稳定的植株再生体系和遗传转化体系,获得了转化植株,为培育广谱抗病的黄瓜品种提供技术支撑,同时近年来普遍认为幽门螺杆菌感染与胃癌发病有关,兔防御素具有抗幽门螺旋菌特性,故希望口服转化兔防御素 NP-1基因的黄瓜对胃癌有一定的预防作用。探讨了影响遗传转化频率的主要因素,获得了阳性转基因植株。主要结果如下:　　(1)津研四号黄瓜子叶再生体系的确定。比较了子叶在12种不同培养基上的分化能力,发现6-BA浓度为2.0mg/L,ABA浓度为1.0mg/L时再生频率最高(60.0％),且生长周期(40-60d)最短,为直接再生途径诱导出芽。　　(2)通过敏感性实验,确定了黄瓜遗传转化过程中选择性抗生素(卡那霉素)抑制子叶分化浓度为100mg/L,抑制植株生根浓度为70mg/L。经过抑菌实验,发现抑菌抗生素青霉头孢素最佳浓度为400mg/L,后期的继代过程中视情况可以逐渐减少。　　(3)对预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和AS浓度一些影响遗传转化效率的重要因素做了初步探讨,初步建立农杆菌介导的黄瓜转基因体系:预培养2d,AS50μM,菌体侵染浓度OD600为0.4-0.6,侵染时间20-25min,共培养时间3d。　　(4)对获得的抗性植株进行PCR分子检测,从中扩增出 NP-1基因特有条带,同时对抗性植株进行Southern分子杂交,将标记有NP-1基因为探针,进行杂交,结果显示一定数量的株系有杂交信号,初步证明外源基因已经整合到津研四号基因组中。提取转化植株的组织蛋白粗提液进行Western杂交,通过摸索优化实验条件,曝光后出现了三条到四条杂交信号,杂交条带都出现在42KD左右,说明目的蛋白在水溶液中以多聚体形式存在,初步证明目的基因在黄瓜中定量表达。　　(5)抗病性研究。在离体抑菌实验中兔防御素 NP-1的转化植株能够对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出良好的抗性,表明整合的外源基因已经在植株中定量表达。