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背景：
心肌梗死(心梗)后心脏重构是心力衰竭和危及生命的心律失常等并发症发病率和死亡率的主要因素[1]。尽管目前经皮冠状动脉介入治疗技术广泛应用于急性心梗发病初始，能迅速开通梗死相关血管，并使用最合理的药物方案进行治疗，但心梗后心脏重构事件仍普遍存在。最初，这种现象是由大面积心肌坏死后室壁应力增加引起的，梗死面积通常是不良重构的重要决定因素[2]。然而，越来越多的研究证实在梗死后组织修复过程中有其他因素的参与，主要涉及精细的、复杂的、多步骤的细胞反应，包括炎症、免疫反应和细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的合成和降解，而这些因素又同时促进了心梗后心脏结构重构和电重构的发生[3,4]。近年来，梗死后炎症，特别是巨噬细胞的活化和极化，以及纤维化在心脏重构进展中的作用引起广泛的关注。心脏巨噬细胞对周边微环境的改变表现出不同的表型和功能(如M1型，促炎或M2型，抗炎)，进而加重或缓解梗死心脏的炎症，恶化或改善心功能。如何促进巨噬细胞向M2极化，关系到心梗后心脏愈合和抗心室重构的改善程度[5]。
C1q/肿瘤坏死相关蛋白(C1q/Tumor necrosis factor-related proteins,CTRPs)是一组由15个新发现的脂联素(Adiponectin, APN)类似蛋白组成的蛋白家族(CTRP1~CTRP15)；其中，CTRP9是CTRPs家族中最接近APN的类似物[6,7]。CTRP9在成人心脏中高表达，其球状结构域异构体(globular domain isoform of CTRP9, gCTRP9)是在心肌组织中通过对全长CTRP9(full length CTRP9, fCTRP9)进行蛋白水解而生成的，是产生心脏保护效应的有效活性成分[8]。虽然既往研究证实CTRP9具有抗炎、心梗慢性期抗心室重构的作用[9,10]，但能否促进心梗早期(7天)巨噬细胞M2极化及其具体机制不详，能否对心梗后心房结构重构和电重构产生影响未有相关研究。在本研究中，我们利用过表达CTRP9腺病毒干预前降支结扎建立的心梗大鼠模型和使用沉默CTRP9腺病毒干预正常大鼠，并通过相应的细胞研究，共同探讨CTRP9对心梗早期心房、心室巨噬细胞极化和心房重构的影响及其可能的机制。
第一部分：CTRP9对大鼠心肌梗死后巨噬细胞极化和左室功能的影响
目的：探讨CTRP9对心肌梗死后大鼠左室功能和巨噬细胞极化的影响。
方法：构建携带CTRP9转录因子的腺病毒(Ad-CTRP9-GFP)和阴性对照的GFP空载病毒(Ad-GFP)、沉默CTRP9转录因子的小发夹腺病毒(Ad-shCTRP9-GFP, shCTRP9)和阴性对照的GFP空载病毒(scramble shRNA-GFP，shRNA)。68只SD大鼠随机分为假手术组(Sham，n=12)、心肌梗死组(MI，n=21)、Ad-GFP+MI组(n=18)和Ad-CTRP9+MI组(n=17)。通过结扎前降支冠脉构建心梗模型。Ad-CTRP9+MI组颈内静脉注射Ad-CTRP9，Ad-GFP+MI组注射等剂量的Ad-GFP，Sham和MI组注射等剂量的PBS；心梗后3天或7天取材。细胞层面上，gCTRP9和/或shRNA分别干预脂多糖(LPS)+干扰素-γ(INF-γ)诱导腹腔巨噬细胞M1型活化或白介素(IL)-4诱导的M2型巨噬细胞模型,并进一步通过使用AMPK抑制剂CompoudC和NF-κB抑制剂PDTC对可能的信号通路进行验证。评估：(1)血浆ELISA法检测每组大鼠CTRP9水平以及Westernblot(WB)检测梗死周边区CTRP9蛋白表达水平；(2)观察各组大鼠的生存状态，统计死亡数，制作生存曲线；(3)Masson染色评估心脏梗死面积；(4)超声评价每组大鼠的LVEDD、EF和FS；(5)PCR和/或WB检测梗死周边区和/或腹腔巨噬细胞M1型标志物(CD86、iNOS)、M2型标志物(Arg1、CD163)、MMP2、pAMPK/AMPK和pNF-κBp65/NF-κBp65；免疫荧光双染检测心肌组织CD86+CD68+、CD163+CD68+表达情况；(6)流式细胞仪技术检测腹腔巨噬细胞iNOS+F4/80+和CD163+F4/80+；(7)ELISA法检测心肌组织和细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-10的生成情况。
结果：心梗后梗死周边区CTRP9表达量下降，经颈内静脉注入Ad-CTRP9后其表达量上升；腺病毒介导的CTRP9补充后在心梗后第3天促进梗死周边区巨噬细胞由M1型向M2型转变。gCTRP9预处理腹腔巨噬细胞促进了在LPS+INF-γ刺激后的M1型巨噬细胞向M2型极化，减轻了炎症反应；gCTRP9进一步加强IL-4诱导下的巨噬细胞向M2型极化；部分沉默巨噬细胞CTRP9基因(shCTRP9)可促进巨噬细胞向M1型转化。CTRP9促使心梗后AMPK磷酸化程度进一步增加，同时抑制NF-κBp65的磷酸化；使用CompoudC后部分抵消了CTRP9促巨噬细胞M2极化的作用，而PDTC却明显增强了这种作用。大鼠心梗后第7天的左心功能显著下降，CTRP9改善了大鼠心梗后心功能；CTRP9并未能改善心梗大鼠早期生存率及梗死面积。
结论：CTRP9可改善心梗早期左心室功能，至少部分通过AMPK/NF-κBp65途径调节巨噬细胞M1型向M2型极化这一过程。
第二部分：CTRP9对大鼠心肌梗死后心房炎症和纤维化的影响
目的：探讨CTRP9对心肌梗死后大鼠心房炎症和纤维化的影响。
方法：病毒构建同第一部分。(1)实验对象分为4组：Sham(n=12)、MI(n=12)、Ad-GFP+MI(n=12)和Ad-CTRP9+MI组(n=10)。心梗后第3天或7天进行取材和检测。(2)实验对象分为2组：shCTRP9组和shRNA组(n=7)。将shCTRP9和shRNA注入正常大鼠体内，在第5天或第10天进行相关检测。评估：(1)PCR或免疫荧光检测心梗后第3天或7天心房CD68表达和CTRP9、IL-1β、IL-6和IL-10mRNA水平；(2)免疫荧光双染检测心房肌组织iNOS+CD68+、CD163+CD68+巨噬细胞的表达情况；PCR检测心房肌组织巨噬细胞标志物iNOS、CD163、CD68和炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA水平；(3)Masson染色评估心房纤维化程度；PCR检测CollagenⅠ和CollagenⅢ水平；WB检测α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平；(4)shCTRP9干预后大鼠的心功能指标：LVEDD、EF和FS；(5)部分沉默CTRP9后使用PCR法检测炎症相关指标IL-1β、IL-6、CD68、iNOS和纤维化指标CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1的mRNA水平;免疫荧光双染检测iNOS+CD68+巨噬细胞的表达情况;(6)WB检测TLR4、pNF-κBp65/NF-κBp65和pSmad2/3/Smad2/3的蛋白表达水平。
结果：大鼠心梗后第3天心房组织的巨噬细胞浸润和炎性因子生成较第7天显著升高；补充CTRP9促进心梗后第3天心房巨噬细胞M2极化，有助于减轻炎症反应。CTRP9通过降低心梗早期心房CollagenⅠ型和Ⅲ型、TGF-β1、a-SMA的生成，从而抑制心房纤维化。部分沉默正常大鼠的CTRP9基因并未改变大鼠的心功能。部分敲除心房CTRP9，可促进心房M1型巨噬细胞浸润和炎性因子生成增多；同时可增加心房纤维化面积和CollagenⅠ型、Ⅲ型、TGF-β1mRNA水平。CTRP9可抑制心梗后心房组织中增多的TLR4和NF-κBp65磷酸化，也可降低Smad2/3磷酸化程度；shCTRP9干预后心房组织TLR4表达增多和NF-κBp65磷酸化程度加重，但对Smad2/3的磷酸化影响不明显。
结论：CTRP9可能通过抑制TLR4/NF-κBp65和Smad2/3信号通路而有效减轻心梗早期心房炎症和纤维化程度。
第三部分：CTRP9对大鼠心肌梗死后心房电重构的影响
目的：探讨CTRP9对大鼠心肌梗死后心房电重构的影响。
方法：实验分组及给药方案同第二部分。心梗后第7天后进行检测，检测指标：(1)免疫荧光双染检测心房CollagenⅠ+α-actinin+、CollagenⅢ+α-actinin+表达情
况，评估AF时程与CollagenⅠ/Ⅲ容积比(CVFⅠ/Ⅲ)相关性。(2)记录大鼠心电图，分析心电图参数P波时限和PR间期；(3)利用Langendorff心脏灌流装置记录心房房间传导时间(IACT)、左右心房有效不应期(LAERP、RAERP)和诱发心房颤动(AF)的发生(AF诱发率、AF时程)；(4)ELISA检测血浆IL-1β、CTRP9表达量，评估CTRP9与AF时程、IL-1β的相关性。
结果：心梗早期P波时限未有明显改变，但PR间期出现延长，CTRP9对心梗后的P波时限未产生明显影响，但缩短了心梗后PR间期；心梗可引起RAERP和LAERP的延长，CTRP9干预后并未缩短延长的AERP；心梗明显增加大鼠的AF诱发率、延长AF时程，CTRP9有效的抑制了心梗后AF的发生。AF时程与IL-1β浓度呈正相关(r=0.93,P<0.001)，与CTRP9浓度呈负相关(r=0.86,P<0.001)；CTRP9与IL-1β浓度呈负相关(r=0.79,P<0.001)。心梗早期，AF时程与CVFⅠ/Ⅲ之间呈正相关(r=0.714,P=0.047)；虽然心梗后心房CVFⅠ/Ⅲ有增加的趋势，但2组间差异无统计学意义，CTRP9并未显著影响心梗后CVFⅠ/Ⅲ。部分沉默正常大鼠心房肌CTRP9后，增加了AF易感性，延长IACT，但对LAERP无明显影响。
结论：补充CTRP9可减少心梗早期AF的发生，很可能与其减轻心房炎症和纤维化的作用相关。
心肌梗死(心梗)后心脏重构是心力衰竭和危及生命的心律失常等并发症发病率和死亡率的主要因素[1]。尽管目前经皮冠状动脉介入治疗技术广泛应用于急性心梗发病初始，能迅速开通梗死相关血管，并使用最合理的药物方案进行治疗，但心梗后心脏重构事件仍普遍存在。最初，这种现象是由大面积心肌坏死后室壁应力增加引起的，梗死面积通常是不良重构的重要决定因素[2]。然而，越来越多的研究证实在梗死后组织修复过程中有其他因素的参与，主要涉及精细的、复杂的、多步骤的细胞反应，包括炎症、免疫反应和细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的合成和降解，而这些因素又同时促进了心梗后心脏结构重构和电重构的发生[3,4]。近年来，梗死后炎症，特别是巨噬细胞的活化和极化，以及纤维化在心脏重构进展中的作用引起广泛的关注。心脏巨噬细胞对周边微环境的改变表现出不同的表型和功能(如M1型，促炎或M2型，抗炎)，进而加重或缓解梗死心脏的炎症，恶化或改善心功能。如何促进巨噬细胞向M2极化，关系到心梗后心脏愈合和抗心室重构的改善程度[5]。
C1q/肿瘤坏死相关蛋白(C1q/Tumor necrosis factor-related proteins,CTRPs)是一组由15个新发现的脂联素(Adiponectin, APN)类似蛋白组成的蛋白家族(CTRP1~CTRP15)；其中，CTRP9是CTRPs家族中最接近APN的类似物[6,7]。CTRP9在成人心脏中高表达，其球状结构域异构体(globular domain isoform of CTRP9, gCTRP9)是在心肌组织中通过对全长CTRP9(full length CTRP9, fCTRP9)进行蛋白水解而生成的，是产生心脏保护效应的有效活性成分[8]。虽然既往研究证实CTRP9具有抗炎、心梗慢性期抗心室重构的作用[9,10]，但能否促进心梗早期(7天)巨噬细胞M2极化及其具体机制不详，能否对心梗后心房结构重构和电重构产生影响未有相关研究。在本研究中，我们利用过表达CTRP9腺病毒干预前降支结扎建立的心梗大鼠模型和使用沉默CTRP9腺病毒干预正常大鼠，并通过相应的细胞研究，共同探讨CTRP9对心梗早期心房、心室巨噬细胞极化和心房重构的影响及其可能的机制。
第一部分：CTRP9对大鼠心肌梗死后巨噬细胞极化和左室功能的影响
目的：探讨CTRP9对心肌梗死后大鼠左室功能和巨噬细胞极化的影响。
方法：构建携带CTRP9转录因子的腺病毒(Ad-CTRP9-GFP)和阴性对照的GFP空载病毒(Ad-GFP)、沉默CTRP9转录因子的小发夹腺病毒(Ad-shCTRP9-GFP, shCTRP9)和阴性对照的GFP空载病毒(scramble shRNA-GFP，shRNA)。68只SD大鼠随机分为假手术组(Sham，n=12)、心肌梗死组(MI，n=21)、Ad-GFP+MI组(n=18)和Ad-CTRP9+MI组(n=17)。通过结扎前降支冠脉构建心梗模型。Ad-CTRP9+MI组颈内静脉注射Ad-CTRP9，Ad-GFP+MI组注射等剂量的Ad-GFP，Sham和MI组注射等剂量的PBS；心梗后3天或7天取材。细胞层面上，gCTRP9和/或shRNA分别干预脂多糖(LPS)+干扰素-γ(INF-γ)诱导腹腔巨噬细胞M1型活化或白介素(IL)-4诱导的M2型巨噬细胞模型,并进一步通过使用AMPK抑制剂CompoudC和NF-κB抑制剂PDTC对可能的信号通路进行验证。评估：(1)血浆ELISA法检测每组大鼠CTRP9水平以及Westernblot(WB)检测梗死周边区CTRP9蛋白表达水平；(2)观察各组大鼠的生存状态，统计死亡数，制作生存曲线；(3)Masson染色评估心脏梗死面积；(4)超声评价每组大鼠的LVEDD、EF和FS；(5)PCR和/或WB检测梗死周边区和/或腹腔巨噬细胞M1型标志物(CD86、iNOS)、M2型标志物(Arg1、CD163)、MMP2、pAMPK/AMPK和pNF-κBp65/NF-κBp65；免疫荧光双染检测心肌组织CD86+CD68+、CD163+CD68+表达情况；(6)流式细胞仪技术检测腹腔巨噬细胞iNOS+F4/80+和CD163+F4/80+；(7)ELISA法检测心肌组织和细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-10的生成情况。
结果：心梗后梗死周边区CTRP9表达量下降，经颈内静脉注入Ad-CTRP9后其表达量上升；腺病毒介导的CTRP9补充后在心梗后第3天促进梗死周边区巨噬细胞由M1型向M2型转变。gCTRP9预处理腹腔巨噬细胞促进了在LPS+INF-γ刺激后的M1型巨噬细胞向M2型极化，减轻了炎症反应；gCTRP9进一步加强IL-4诱导下的巨噬细胞向M2型极化；部分沉默巨噬细胞CTRP9基因(shCTRP9)可促进巨噬细胞向M1型转化。CTRP9促使心梗后AMPK磷酸化程度进一步增加，同时抑制NF-κBp65的磷酸化；使用CompoudC后部分抵消了CTRP9促巨噬细胞M2极化的作用，而PDTC却明显增强了这种作用。大鼠心梗后第7天的左心功能显著下降，CTRP9改善了大鼠心梗后心功能；CTRP9并未能改善心梗大鼠早期生存率及梗死面积。
结论：CTRP9可改善心梗早期左心室功能，至少部分通过AMPK/NF-κBp65途径调节巨噬细胞M1型向M2型极化这一过程。
第二部分：CTRP9对大鼠心肌梗死后心房炎症和纤维化的影响
目的：探讨CTRP9对心肌梗死后大鼠心房炎症和纤维化的影响。
方法：病毒构建同第一部分。(1)实验对象分为4组：Sham(n=12)、MI(n=12)、Ad-GFP+MI(n=12)和Ad-CTRP9+MI组(n=10)。心梗后第3天或7天进行取材和检测。(2)实验对象分为2组：shCTRP9组和shRNA组(n=7)。将shCTRP9和shRNA注入正常大鼠体内，在第5天或第10天进行相关检测。评估：(1)PCR或免疫荧光检测心梗后第3天或7天心房CD68表达和CTRP9、IL-1β、IL-6和IL-10mRNA水平；(2)免疫荧光双染检测心房肌组织iNOS+CD68+、CD163+CD68+巨噬细胞的表达情况；PCR检测心房肌组织巨噬细胞标志物iNOS、CD163、CD68和炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA水平；(3)Masson染色评估心房纤维化程度；PCR检测CollagenⅠ和CollagenⅢ水平；WB检测α-SMA和TGF-β1蛋白表达水平；(4)shCTRP9干预后大鼠的心功能指标：LVEDD、EF和FS；(5)部分沉默CTRP9后使用PCR法检测炎症相关指标IL-1β、IL-6、CD68、iNOS和纤维化指标CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1的mRNA水平;免疫荧光双染检测iNOS+CD68+巨噬细胞的表达情况;(6)WB检测TLR4、pNF-κBp65/NF-κBp65和pSmad2/3/Smad2/3的蛋白表达水平。
结果：大鼠心梗后第3天心房组织的巨噬细胞浸润和炎性因子生成较第7天显著升高；补充CTRP9促进心梗后第3天心房巨噬细胞M2极化，有助于减轻炎症反应。CTRP9通过降低心梗早期心房CollagenⅠ型和Ⅲ型、TGF-β1、a-SMA的生成，从而抑制心房纤维化。部分沉默正常大鼠的CTRP9基因并未改变大鼠的心功能。部分敲除心房CTRP9，可促进心房M1型巨噬细胞浸润和炎性因子生成增多；同时可增加心房纤维化面积和CollagenⅠ型、Ⅲ型、TGF-β1mRNA水平。CTRP9可抑制心梗后心房组织中增多的TLR4和NF-κBp65磷酸化，也可降低Smad2/3磷酸化程度；shCTRP9干预后心房组织TLR4表达增多和NF-κBp65磷酸化程度加重，但对Smad2/3的磷酸化影响不明显。
结论：CTRP9可能通过抑制TLR4/NF-κBp65和Smad2/3信号通路而有效减轻心梗早期心房炎症和纤维化程度。
第三部分：CTRP9对大鼠心肌梗死后心房电重构的影响
目的：探讨CTRP9对大鼠心肌梗死后心房电重构的影响。
方法：实验分组及给药方案同第二部分。心梗后第7天后进行检测，检测指标：(1)免疫荧光双染检测心房CollagenⅠ+α-actinin+、CollagenⅢ+α-actinin+表达情
况，评估AF时程与CollagenⅠ/Ⅲ容积比(CVFⅠ/Ⅲ)相关性。(2)记录大鼠心电图，分析心电图参数P波时限和PR间期；(3)利用Langendorff心脏灌流装置记录心房房间传导时间(IACT)、左右心房有效不应期(LAERP、RAERP)和诱发心房颤动(AF)的发生(AF诱发率、AF时程)；(4)ELISA检测血浆IL-1β、CTRP9表达量，评估CTRP9与AF时程、IL-1β的相关性。
结果：心梗早期P波时限未有明显改变，但PR间期出现延长，CTRP9对心梗后的P波时限未产生明显影响，但缩短了心梗后PR间期；心梗可引起RAERP和LAERP的延长，CTRP9干预后并未缩短延长的AERP；心梗明显增加大鼠的AF诱发率、延长AF时程，CTRP9有效的抑制了心梗后AF的发生。AF时程与IL-1β浓度呈正相关(r=0.93,P<0.001)，与CTRP9浓度呈负相关(r=0.86,P<0.001)；CTRP9与IL-1β浓度呈负相关(r=0.79,P<0.001)。心梗早期，AF时程与CVFⅠ/Ⅲ之间呈正相关(r=0.714,P=0.047)；虽然心梗后心房CVFⅠ/Ⅲ有增加的趋势，但2组间差异无统计学意义，CTRP9并未显著影响心梗后CVFⅠ/Ⅲ。部分沉默正常大鼠心房肌CTRP9后，增加了AF易感性，延长IACT，但对LAERP无明显影响。
结论：补充CTRP9可减少心梗早期AF的发生，很可能与其减轻心房炎症和纤维化的作用相关。