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啶虫脒是一种广谱新烟碱类杀虫剂,也是一种新型的农药,现已经被越来越多的国家投入使用,而我国啶虫脒的年产量已超过了5000吨。啶虫脒是一种具有一定杀螨活性的杀虫剂,其作用于土壤和枝叶的系统。广泛用于水稻,尤其蔬菜、果树、茶叶的蚜虫、飞虱、蓟马、部分鳞翅目害虫等的防治。但作为杀虫剂它仍具有低毒性,并且在生态系统中被广泛的检测到,在这个越来越重视生态的社会中,引起了广泛的关注。啶虫脒污染的生物修复被认为是一种有效、可靠和无再次污染的方法。因此,筛选高效降解啶虫脒的微生物菌种资源,探索其降解啶虫脒的作用机理,充分发挥其降解能力,具有重大的理论意义和实际应用价值。本实验研究的意义在于分离、筛选高效降解啶虫脒的微生物菌株,并对菌株在不同环境条件下降解啶虫脒的特性进行研究,以期为啶虫脒污染环境的修复提供理论依据;同时克隆降解啶虫脒的关键酶基因,进一步研究该降解酶的特性。本文通过富集培养的方法,从被啶虫脒污染的土样中筛选出5株啶虫脒降解菌株,分别命名为22-5、DF-1、Y-3、DY-17、YF-20。选取其中降解啶虫脒效果最好的一株菌DY-17作为研究对象,通过革兰氏染色及在电镜下的照片确定其为一株革兰氏阴性的杆菌。采用SDS高盐法从啶虫脒降解菌DY-17中提取高质量的染色体总DNA,作为模板通过16S rRNA基因系统发育分析初步鉴定为Pseudomonas sp.中的一个新成员,并根据比对结果构建系统发育树。对啶虫脒降解菌DY-17的生理特性进行研究,得出啶虫脒降解菌株DY-17降解活性的最适条件为:37℃,pH为7,啶虫脒浓度为200 mg/L;该研究结果为啶虫脒污染环境的生物修复提供了菌种资源。将所提取的细菌总DNA,建立基因组文库。约从12000个转化子中筛选出了一个具有啶虫脒降解活性的阳性克隆子。用软件分析确定了其为腈水合酶结构基因。将啶虫脒的腈水合酶结构基因和腈水合酶结构基因下游的激活蛋白连接到表达载体pET29a上,再分别将腈水合酶和腈水合酶与激活蛋白转化到Ecoli.BL21(DE3)表达;进行SDS-PAGE分析,从电泳图我们获得了腈水合酶结构基因的α亚基大小为26 kDa,β亚基大小为25 kDa,激活蛋白分子大小为48kDa。从实验中我们可以得出:啶虫脒降解菌株腈水合酶基因单独表达时活性较低,以可溶性表达的量比较少,酶的活性较弱;当与激活蛋白共表达时,以可溶性表达的量增加,酶的活性增强,说明激活蛋白可能起着类似分子伴侣的作用,帮助腈水合酶正确折叠,形成有功能的空间构象。这将为新烟碱类杀虫剂污染的微生物修复提供基础。