肥胖是一种机体脂肪组织总含量过多和(或)局部含量增多及分布异常的慢性代谢性疾病。肥胖病人发生心血管疾病(CVD)、高血压、血脂异常、2型糖尿病、脂肪肝及某些癌症的风险增高,是目前位居全球第5位的死亡原因。近20年,中国肥胖人口比例逐年呈上升和年轻化趋势,流行程度已经接近发达国家水平(美国等发达国家肥胖比例超过1/3),严重威胁我国国民体质与生命健康,已成为我国亟需解决的重大公共卫生问题。肥胖是脂肪细胞数量的增加以及脂肪细胞的体积变大双重作用的结局,其中脂肪细胞体积增大(取决于脂肪细胞分化程度)较之其数目增多对体内脂肪的含量及代谢稳态的影响更为显著；脂肪组织中脂肪间充质干细胞或脂肪前体细胞在遗传、环境、饮食等各种因素作用下改变了增殖分化潜能可能是肥胖难以控制的细胞生物学基础；因此,以人脂肪组织来源的间充质干细胞(Human adipose-derived mesenchymal stem cells,HMSC-Ad)为研究对象,深入研究其基本属性,特别是从脂肪细胞分化的角度寻找肥胖防治新靶标、新机制、深入研究相关机制仍十分必要,并可能为肥胖及相关代谢性疾病提供潜在的分子靶标。近年来随着生命科学技术的迅猛发展,对发育、疾病机制的解释越来越丰富,已经不再局限于基因或蛋白水平,以往被认为是转录垃圾、不编码蛋白的非编码RNA因为功能巨大而逐渐受到重视。其中一类长度仅22nt、在基因转录后水平实现负向调控基因的非编码小RNA分子——microRNA(miRNA)在各个领域最为活跃,极大拓宽了人们对生物发育、疾病发生发展的认识。虽然发现miRNA距今仅20年,但目前至少已有20多项miRNA相关药物的研发进入临床试验阶段。而miRNA一对多、多对一的作用方式(一个miRNA调控多个基因或多个miRNA对同一个基因进行时空特异的精密调控),无疑是解决复杂疑难疾病的新切入点。miRNA在肥胖、脂肪细胞分化中的作用已有部分研究,但是与miRNA的总数相比微乎其微,因此继续探讨肥胖相关miRNA功能与机制研究,将给肥胖与相关代谢性疾病的防治带来福音。本课题组前期通过miRNA芯片技术,筛选人脂肪间充质干细胞及成熟脂肪细胞的miRNA差异表达谱,结果发现miR-148a在脂肪细胞分化前后差异表达特征十分显著,结合Dicer(生成miRNA的关键酶)脂肪特异性敲除可以导致小鼠脂肪发育异常的报道,提示miRNA在脂肪细胞分化的重要作用。因此,本研究首先从细胞、动物、人群不同水平探讨miR-148a与肥胖的相关性,并通过生物信息学分析miR-148a作用的靶基因集合富集的信号通路和功能集合,为深入开展miR-148a在肥胖发生中的功能研究提供实验及理论基础；进一步以HMSC-Ad为研究对象,探讨miR-148a在HMSC-Ad成脂分化中的作用,并阐明miR-148a下游分子途径及上游转录调控机制,有望为肥胖及其并发症防治提供新线索及潜在的干预靶标。第一部分miR-148a与肥胖相关性的探讨目的：通过观察miR-148a在脂肪细胞、肥胖者脂肪组织、高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导肥胖小鼠脂肪组织中的表达特征,并对miR-148a进行生物信息分析,探讨miR-148a与肥胖的相关性,为阐明miR-148a在肥胖中作用提供理论和实验基础。方法：选择人脂肪组织来源的间充质干细胞HMSC-Ad、人脂肪前体细胞Pre-Ad (Human pre-adipocyte)、小鼠脂肪前体细胞3T3-L1细胞,以胰岛素、地塞米松、罗格列酮(3T3-L1细胞除外)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)方案诱导各细胞分化为成熟脂肪细胞；选取肥胖/超重人群(BMI≥24)皮下脂肪组织12例,以BMI(17-23.9)正常人群皮下脂肪组织(18例)为对照；构建HFD诱导肥胖小鼠模型,获取皮下脂肪组织；针对上述样本,采用Realtime PC技术检测miR-148a在脂肪细胞、肥胖者、HFD小鼠脂肪组织中的表达水平；采用miRBase检索miR-148a的序列特征,分析其物种保守性；采用TargetScan、Pictar和miRanda数据库检索miR-148a的靶基因,取三者交集得到靶基因结合,对靶基因集合进行GO分析和pathway分析。结果：1) miR-148a在HMSC-Ad、Pre-Ad、3T3-L1诱导分化成熟的脂肪细胞中呈高表达模式；2)与BMI正常人群相比,miR-148a高表达于肥胖者腹部皮下脂肪组织；3) miR-148a在HFD诱导肥胖小鼠皮下脂肪组织中呈高表达特征；4)miR-148a具有物种保守性,对miR-148a的靶基因进行GO分析和pathway分析,结果发现,靶基因功能主要富集于肥胖胰岛素抵抗及脂肪细胞分化密切相关的信号通路,如Wnt信号通路、TGF-β信号通路、胰岛素信号通路、脂因子信号通路、细胞周期信号通路和DNA甲基化。结论：通过检测不同肥胖生物中miR-148a的表达,发现miR-148a与肥胖密切相关,表现为在肥胖者脂肪组织、分化成熟脂肪细胞中高表达,miR-148a靶基因功能富集于肥胖及脂肪细胞分化相关的信号通路,为后续进行miR-148在肥胖中的功能研究奠定了理论和实验基础。第二部分miR-148a过表达对HMSC-Ad成脂分化的影响及机制研究目的：观察miR-148a过表达对人脂肪间充质干细胞(HMSC-Ad)成脂分化的影响,并探讨其促进成脂分化的机制。方法：体外培养稳定感染miR-148a慢病毒的HMSC-Ad细胞,以转染空载病毒的HMSC-Ad细胞为对照,胰岛素、地塞米松、罗格列酮、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)方案诱导细胞分化成熟。油红O观察HMSC-Ad成脂分化过程中脂滴形成情况；酶比色法检测成熟脂肪细胞中的甘油三酯含量；检测成熟脂肪细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)酶的活性。采用Realtime PC及Western Blot技术,检测脂肪细胞分化关键基因(PPARγ2、C/EBP-α、FABP4)及miR-148a靶基因Wnt1的mRNA及蛋白水平；同时检测经典Wnt信号通路中信号分子(GSK-3β、 p-GSK-3β、β-catenin)蛋白水平。采用萤光素酶报告系统筛选miR-148a可能作用的信号通路及靶基因。结果：1)过表达miR-148a促进HMSC-Ad诱导的成熟脂肪细胞脂滴形成、甘油三酯合成、GPDH活性,上调脂肪细胞分化关键基因PPARγ2、C/EBP-α、FABP4mRNA及蛋白水平的表达；2) miR-148激活PPRE萤光素酶活性(PPAR反应元件)、抑制经典Wnt信号通路Report TopFlash萤光素酶活性；3) miR-148a可结合至靶基因Wnt13’UTR区并抑制其蛋白表达；4) miR-148a过表达抑制经典Wnt信号通路中Wnt1总蛋白表达、增力p-GSK-3β水平,而β-cateni入核水平减少；5)miR-148a可部分逆转Wnt1对HMSC-Ad成脂分化的抑制作用,即在HMSC-Ad中敲低Wnt1基因可促进成脂分化关键基因表达及脂滴的形成(与miR-148a过表达产生的作用一致),而miR-148a与Wnt1在HMSC-Ad中共表达或miR-148a过表达可部分阻断由Wnt1过表达所致的作用(脂滴形成减少、脂肪细胞分化关键基因表达下调等)。结论：1) miR-148a过表达促进HMSC-Ad成脂分化：2) miR-148在转录后水平调控靶基因Wnt1的表达,从而抑制经典Wnt信号通路活性,并阻断Wnt1对HMSC-Ad成脂分化的抑制作用,提示miR-148a是促进HMSC-Ad成脂分化的上游调控因素,并非是分化产生的效应。第三部分miR-148a在人脂肪源性间充质干细胞中的转录调控机制目的：寻找miR-148a核心启动子区域并探讨miR-148在HMSC-Ad中的转录调控机制。方法：应用NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等工具预测miR-148a启动子区域,采用TFSEARCH预测miR-148a启动子区域与脂肪细胞分化有关的转录因子结合位点；构建启动子荧光蛋白检测报告质粒,转染至HEK293T细胞,72h内采用荧光显微镜观察报告荧光蛋白的表达；采用双萤光素酶报告系统,检测克隆不同区域miR-148a启动子的活性；EMSA和ChIP-qPCR分析何种转录因子可结合至miR-148a启动子区域；采用Realtime PCR检测miR-148a表达水平,评价在HMSC-Ad细胞中过表达转录因子CREB对miR-148a表达的影响。结果：1)启动子分析发现miR-148a属于基因间RNA(intergenic),具有独立启动子,具有CpG岛,预测其可能的启动子区域位于pre-miR-148a上游3000kb处,并发现其启动子区域存在脂肪细胞分化相关转录因子CREB、E2F、CEBP等结合位点；2) pre-miR-148a上游(-2947to-2687nt)处为miR-148a核心启动子区域,并具有转录因子CREB结合位点；3)在HMSC-Ad细胞中,采用EMSA证实CREB、E2F可结合至miR-148a启动子区域(-2947to-2687nt),同时ChlP-qPCR检测发现含有CREB结合位点的区域(-2947to-2687nt) IP表达量是input的320倍；4)HMSC-Ad细胞中过表达CREB, miR-148a滚达水平较对照组增加2.6倍。反之,HMSC-Ad细胞中沉默CREB, miR-148a表达水平较对照组降低约70%。结论：CREB(一种与脂肪细胞分化密切相关的转录因子)结合至miR-148a启动子区域,调控miR-148a的表达,提示miR-148a是CREB依赖的miRNA。