研究背景人工合成化学物双酚A（BisphenolA，BPA）是合成聚碳酸酯和环氧树脂的主要单体，工业上广泛应用于奶瓶、食品和饮料包装材料等人类日常生活用品，医疗设备以及热敏纸等的制造。随着需求量的逐渐增加，BPA已经成为世界上高产量化学物之一。在酸性环境或加热情况下，BPA会从这些物品中释放出来，经消化道、呼吸道和皮肤等多种途径进入人体，人群调查显示人类已广泛暴露于环境BPA。作为一种已公认的环境内分泌干扰化学物（environmentalendocrine disrupting chemical，EDC），BPA具有弱雌激素活性，可以对包括内分泌、神经行为、生殖发育等产生不良影响，对人类健康造成极大威胁。近年来，有研究显示围生期母体BPA暴露对子代出生后免疫功能有明显影响，如改变CD4+T细胞亚群辅助性T细胞（help T cell，Th）1和Th2的平衡，减少调节性T细胞（T regulation cell，Treg cell）数量等。Th17细胞是近年来新发现的一类CD4+T细胞亚群，通过分泌促炎细胞因子IL-17等发挥作用，参与炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生和发展。然而，到目前为止，围生期BPA暴露对出生后子代Th17细胞有何影响尚无报道。维生素D是机体生长发育所必需的一类维生素，研究显示维生素D在免疫应答中也发挥重要的调节作用，可以抑制Th17细胞的增殖和分化。维生素D对BPA诱导的Th17改变有何调节作用目前还不清楚，但这对BPA免疫危害的防治具有重要意义。研究目的通过检测围生期饮水摄入不同剂量BPA母鼠所生子代出生后不同时期脾脏Th17细胞数量、特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体（retinoic acidrelated orphan receptor gamma t，RORγt）mRNA水平和血清中白介素（interleukin，IL）-6、IL-17、IL-21、IL-23、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）含量，探讨母鼠围生期BPA暴露对子代出生后Th17细胞的影响。通过检测围生期饮水暴露上述高剂量BPA且腹腔注射补充不同剂量维生素D的母鼠所生子代出生后不同时期上述指标的改变，探讨维生素D补充对母鼠围生期BPA暴露所致子代Th17细胞影响的改善效应。研究方法选用8周龄ICR雌鼠和9周龄ICR雄鼠饲养于清洁级动物房，适应性饲养1周后，交配查到阴栓确认为受孕。将孕鼠分为空白对照组、溶剂对照组、10nM BPA组、100nM BPA组、1000nM BPA组、1000nM BPA+0.25μg/kg维生素D组、1000nMBPA+1μg/kg维生素D组、1000nM BPA+4μg/kg维生素D组。母鼠自孕第一天（gestation day0，GD0）至断乳（postnatal day21，PND21）每天经饮水暴露BPA，同时每天经腹腔注射给予BPA高剂量组母鼠一次维生素D。在子代PND21、PND42时，采集外周血，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清IL-6、IL-17、IL-21、IL-23、TGF-β含量；处死小鼠，雌雄各半，无菌取脾脏，采用流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测脾脏Th17细胞数量，并以CD4+细胞中IL-17+细胞所占的比例表示。实时荧光定量聚合酶链反应（realtime-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测Th17细胞特异转录因子RORγt mRNA表达水平，用SPSS13.0统计软件包对实验结果进行统计分析。结果1一般情况试验期间各组孕鼠一般情况良好，在孕期未观察到死亡、流产、死胎和死产现象。孕期各组母鼠体重增长差异无统计学意义；出生后至断乳时各组子鼠的平均窝仔数、平均体重没有统计学差异；PND42时BPA高剂量组体重高于空白对照组（P<0.05），断乳后其余各组间体重均无统计学意义。2母鼠围生期饮水摄入BPA对子代Th17细胞的影响2.1对子代Th17细胞分化等相关指标表达的影响PND21和PND42时，空白对照组和溶剂对照组相比，子鼠脾脏Th17数量和RORγt mRNA水平、血清IL-6、TGF-β和IL-23水平差异均没有统计学意义；除血清TGF-β水平外，其他指标均随BPA暴露剂量的增加而升高；与对照组相比，除血清TGF-β水平外，BPA中、高剂量组其他指标均升高（P<0.05，P<0.01）。PND42时，除血清TGF-β水平外，BPA中、高剂量组其他指标较PND21时有所下降，BPA低剂量组RORγt mRNA水平也较PND21时有所降低，但差异均无统计学意义。相关性分析显示，脾脏Th17细胞数量与RORγt mRNA表达水平、血清中IL-6、IL-23含量均存在显著正相关（r=0.771，0.818，0.795，P<0.05）。2.2对子代Th17细胞特征性细胞因子分泌的影响在PND21和PND42时，两个对照组血清IL-17水平差异没有统计学意义；血清IL-17水平随BPA剂量的增加而升高。PND21时，BPA中剂量和高剂量组IL-17水平显著高于对照组（P<0.01）；PND42时，BPA中剂量组高于对照组（P<0.05），BPA高剂量组明显高于对照组（P<0.01）。PND42时各BPA暴露组血清IL-17水平较PND21时有所降低，但差异没有统计学意义。相关性分析显示，脾脏Th17细胞数量与血清中IL-17含量均存在显著正相关（r=0.855，P<0.05）。2.3对子代Th17细胞扩增相关细胞因子分泌的影响在PND21和PND42时，两个对照组血清IL-21水平差异没有统计学意义；血清IL-21水平随BPA剂量的增加而升高。PND21时，BPA低剂量组血清IL-21水平高于对照组（P<0.05），中剂量和高剂量组血清IL-21水平显著高于对照组（P<0.01）；PND42时，BPA中、高剂量组血清IL-21水平明显高于对照组（P<0.05）。PND42时，BPA各组血清IL-21水平较PND21时有所降低，但差异没有统计学意义。相关性分析显示，脾脏Th17细胞数量与血清中IL-21含量均存在显著正相关（r=0.709，P<0.05）。3维生素D补充对母鼠围生期BPA暴露所致子代Th17细胞相关指标增加的影响3.1对子代Th17细胞分化等相关指标表达增强的影响母鼠腹腔注射不同剂量维生素D对围生期1000nM BPA暴露引起的子代脾脏Th17细胞数量和RORγt mRNA表达水平、血清IL-6和IL-23水平上升具有抑制作用，且呈现一定的剂量反应关系。在PND21和PND42时，与1000nM BPA组比较，维生素D中、高剂量补充组上述四个指标明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与空白对照组相比，除PND42时维生素D中剂量组IL-23外，维生素D低、中剂量补充组上述指标明显升高，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），仅维生素D高剂量补充组升高不明显，差异没有统计学意义。腹腔注射不同剂量维生素D对围生期1000nM BPA暴露母鼠所生子代PND21和PND42时TGF-β水平影响不明显，各组之间差异没有统计学意义。3.2对子代Th17细胞特征性细胞因子分泌增强的影响腹腔注射不同剂量维生素D对母鼠围生期1000nM BPA暴露引起的IL-17水平上升具有抑制作用，且呈现一定的剂量反应关系。PND21时，与1000nM BPA组比较，维生素D中、高剂量补充组IL-17水平下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与对照组相比，维生素D低剂量补充组IL-17水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与空白对照组相比，维生素D中剂量补充组升高（P<0.05）；而与对照组相比，维生素D高剂量补充组IL-17水平升高不明显，差异已没有统计学意义。PND42时，与1000nM BPA组比较，维生素D中、高剂量补充组IL-17水平明显下降，差异具有统计学差异（P<0.01）；与对照组相比，维生素D低剂量补充组IL-17水平升高（P<0.05），而维生素D中、高剂量补充组IL-17水平升高不明显，差异已没有统计学意义。3.3对子代Th17细胞扩增相关细胞因子分泌增强的影响腹腔注射不同剂量维生素D对母鼠围生期1000nM BPA暴露引起的子代血清IL-21水平上升具有抑制作用，且呈现一定的剂量反应关系。PND21时，维生素D中剂量组和维生素D高剂量组两指标高于BPA高剂量组（P<0.05），且维生素D高剂量组更加明显（P<0.01）。维生素D低剂量组和维生素D中剂量组两指标显著高于空白对照组（P<0.01，P<0.05）。PND42时，维生素D低剂量组IL-21水平显著高于空白对照组（P<0.01），维生素D中剂量组IL-21水平高于空白对照组（P<0.05），维生素D各组IL-21水平与BPA高剂量组差异没有统计学意义。结论1母鼠围生期经水摄入BPA对子代出生后不同时期Th17细胞有显著的影响，导致Th17细胞数量升高、特异性转录因子RORγt mRNA表达上调、血清Th17细胞分泌和功能相关的细胞因子IL-6、IL-17、IL-21、IL-23含量增高。2维生素D补充对母鼠围生期BPA暴露引起的子代Th17细胞改变具有显著的影响，维生素D可抑制母鼠BPA暴露所致子代Th17细胞上述指标的升高。3. BPA可能通过促进Th17细胞增殖和分化的细胞因子分泌，上调特异性转录因子表达，从而增加Th17细胞的数量和其分泌的细胞因子水平。