研究背景氧化应激(Oxidative Stress, OS)是指机体在遭受有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)产生过多,氧化系统和抗氧化系统失衡所致的应激损伤[1]。氧化应激如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)可直接作用于蛋白质,促进S-S键形成,碳链断裂、降解,及共价氧化修饰(如羰基化等),最终导致蛋白质的错误折叠和失活,引起细胞和组织的损伤,并参与心血管疾病、器官纤维化、创伤愈合延迟、糖尿病、神经退行性变及衰老和肿瘤等多种疾病发生进程[2,3]热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs),是体内重要的分子伴侣蛋白,具有高度保守性质且高效表达的一组蛋白质。“热休克”一词的使用是由于其许多家族成员如(Hsp90及Hsp70等)均能在多种应激状态中包括高温、低氧、氧化损伤被诱导产生。根据其分子的大小,对其命名,如将Hsps分成大分子Hsp(110～100kDa)、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、小分子Hsp(<30kDa)家族[4,5]。热休克蛋白90(heat shock protein, Hsp90),是真核细胞中参与细胞保护作用的重要分子伴侣蛋白之一。在正常状态下,占细胞内总蛋白的1-2%,但一旦受到应激诱导,可上调至细胞内总蛋白的4-6%[6]。由于其200余种底物蛋白参与细胞内的多种重要信号通路的调节,Hsp90已成为肿瘤治疗的重要靶点,及多种药物开发及研制工作的热点,Hsp90也因此被称为“肿瘤伴侣”[4,7]。人类Hsp90分为四种亚型,胞浆内的Hsp90αα和Hsp90β,内质网的GRP94以及线粒体基质内的Hsp75/肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor necrosis factor receptor associated protein1, TRAP1)。目前认为这4个成员的作用方式类似,仅由于它们在细胞内的定位不同,因此各自所结合的蛋白不尽相同[9,10]。Hsp90α与Hsp90β在正常生理条件下均有表达,应激状态下如高温、感染可诱导其合成增加,但诱导因素有所不同。相比之下,Hsp90a易受应激诱导,并在在肿瘤细胞增殖中起重要作用；而Hsp90β主要是细胞内的构成性表达,易受有丝分裂的诱导,与细胞分化和结构构建有关。在本次实验中,我们选用Hsp90a作为主要研究对象,关注其在氧化应激中的调控机制。过氧化氢(H202)可透过细胞膜,能在细胞间和细胞内自由扩散[1],同时也是细胞内最丰富的活性氧簇ROS (reactive oxygen species, ROS)之一[12]参与调节新陈代谢、老年性疾病、凋亡和生长因子相关的信号通路[11]。尽管其本身会迅速与信号分子反应而失活,但其造成级联反应能导致氧化应激持续存在,使其成为氧化应激研究的重要工具药。但是,过氧化氢的最终工作浓度及热休克蛋白在肿瘤细胞和正常细胞在氧化应激状态中的相互关系仍不明确。在正常生理条件下,机体内的抗氧化防御系统可及时清除自由基(如ROS, RNS),维持机体的氧化还原平衡；但在病理条件下,当产生的自由基超过机体抗氧化防御能力时,自由基即在机体内蓄积,导致机体氧化应激。目前有研究表明,一方面氧化应激或脂质过氧化造成的DNA氧化损伤是肿瘤发生的重要致病机理[13],另一方面肿瘤细胞对氧化应激的敏感性高于正常细胞,但其具体机制仍有待阐明。因此,测定氧化应激模型中及培养基中过氧化氢的工作浓度,探讨过氧化氢诱导的氧化应激模型中,不同细胞系的应激反应及Hsp90对其的可能调控机制,必将对研究氧化应激相关疾病的发生机制和预防提供新的思路。目的：1.研究不同氧化应激环境中,不同培养基(DMEM、RPMI1640)及不同细胞(HepG2、L02)对H202的消减情况；2.建立HepG2、L02细胞氧化应激模型；3.确定HepG2、L02细胞在相同氧化应激条件下细胞内氧化应激状态的变化；4.研究氧化应激条件下,HepG2、L02细胞内Hsp90a的表达情况；5.明确人肝癌组织中Hsp90a的表达情况,进一步探讨在氧化应激条件下,热休克蛋白在氧化应激条件下对细胞保护作用的可能的分子机制。方法：1.建立氧化应激细胞模型：将HepG2细胞及L02细胞分为对照组、氧化应激组。氧化应激因素：H202起始浓度为100μM、200μM、500μM、1000μM,分别刺激2h,4h,6h,8h,10h,12h,24h,48h。cck-8比色法观察氧化应激不同时间点细胞存活情况；2.测定培养基中过氧化氢最终作用浓度：实验分组为含HepG2、L02细胞氧化应激组、不含细胞氧化应激组；氧化应激因素：H202起始浓度为：1OOμM、200μM、500μM、1000μM。通过FOX (Ferrous Oxidation of Xylenol Orange)方法测定过氧化氢在不同培养基中的最终作用浓度；3.通过CCK-8比色法观察氧化应激不同时间后细胞的存活情况。确定HepG2、L02细胞在相同终末H2O2浓度下有氧化应激损伤效应的的时间浓度点；4.将HepG2细胞及L02细胞分为对照组、氧化应激组。氧化应激固素：100μM H2O2,分别作用于细胞20min,40min,60min,80min,100min,120min。通过ROS探针法检测]HepG2、L02细胞在氧化应激的不同时程中ROS的含量。比色法测定HepG2、L02细胞在氧化应激的不同时程中细胞内谷胱甘肽(GSH)含量；5.免疫印迹法检测在H2O2刺激不同时间点的Hsp90a、Hsp70、Hsp40蛋白表达情况；6.免疫组化法检测Hsp90a与Hsp70、Hsp40在人肝癌组织中的表达情况。结果：1.不同浓度的过氧化氢对细胞的存活存在双向性作用：在过氧化氢浓度作用不同时间的条件下,高浓度过氧化氢1000μM抑制HepG2细胞生存率,500μM过氧化氢则是先抑制增长后刺激增长,而低浓度过氧化氢(100-200μM)则轻度刺激HepG2细胞增长；在RPMI1640培养L02细胞中表现为,100μM过氧化氢刺激2h内生长率稍下降,之后仍保持正常生长率,但总生长率低于正常对照组,其它过氧化氢浓度(200-1000μM)对细胞产生的氧化应激损伤随浓度增加而不断增强；2.不同培养基对过氧化氢存在不同的消减作用：在DMEM培养基中,起始浓度为1000μM过氧化氢可持续48小时,其余浓度(100,200,500μM)在2小时内就消减至基线水平；在RPMI1640培养基中,相同起始浓度过氧化氢呈缓慢消减趋势。此外,含培养细胞的上述培养基,对过氧化氢的消减作用,与单纯培养基对过氧化氢的消减作用类似。即：在含贴壁培养的HepG2细胞的DMEM培养基中,过氧化氢的消减趋势与上述过氧化氢在DMEM培养基消减趋势相同,低起始浓度过氧化氢(100,200μM)在40分钟即消减至基线水平,500μM起始浓度的过氧化氢可持续至2小时,10001μM起始浓度的过氧化氢可持续至10小时。在含贴壁培养的L02细胞的RPMI1640培养基中,过氧化氢消减趋势缓慢,在4-10小时消减到基线水平；3. HepG2细胞较L02细胞对过氧化氢诱导的氧化应激更为敏感：在RPMI1640培养的HepG2及L02细胞中,随着H202刺激细胞时间的延长,细胞存活率持续下降,100μM过氧化氢作用2小时后,HepG2细胞存活率仅为39%(39.82±2.84),而L02细胞存活率为80%(80.80±3.69)。因此,选取100μM过氧化氢在RPMI1640中作用2小时作为氧化应激模型；4.过氧化氢诱导的氧化应激导致HepG2细胞抗氧化能力损伤较L02细胞更为严重：氧化应激后细胞内ROS的含量不断增多,且HepG2细胞高于L02细胞；L02细胞内Glutathione(GSH)含量随着氧化应激程度的加深也不断减少,但仍明显高于HepG2细胞；5.氧化应激对HepG2和L02细胞内Hsp90α、Hsp70、Hsp40的表达量影响存在差异：氧化应激导致HepG2细胞内Hsp90a蛋白表达量增加,20-60分钟出现高峰,80-120分钟水平下降渐至正常,L02细胞与HepG2细胞呈相同趋势,但Hsp90a蛋白表达量在20-40分钟出现高峰,60分钟后蛋白表达水平下降渐至正常,且HepG2细胞出现Hsp90a切割片段时间(40分钟)早于L02细胞的出现时间(80分钟)。随氧化应激时间延长,Hsp70、Hsp40蛋白表达总量表达与Hsp90a类似,但无Hsp90a变化明显；6.免疫组化检测人肝癌组织中Hsps的表达量：在人肝癌组织中,Hsp90a较Hsp70和Hsp40呈现高表达。结论：1.氧化应激状态下,由于培养基及细胞类型对H202的消减作用不同,可能影响实验结果；2.正常肝细胞和肝癌细胞在氧化应激环境中均存在双向性反应；3. HepG2由于基础氧化应激水平高于L02细胞,因此,对外来氧化应激错敏感性高于L02细胞；4.氧化应激状态下,正常肝细胞和肝癌细胞Hsp90a的表达量变化较Hsp70, Hsp40的变化明显,且降解程度有变化,Hsp90a出现切割条带且肝癌细胞(40min)早于正常细胞(80min)。提示Hsp90a较Hsp70, Hsp40寸氧化应激更为敏感,且肝癌细胞中Hsp90a的氧化应激敏感性高于正常细胞；5.肿瘤细胞氧化应激基础水平高于正常细胞,相同于Hsp70、Hsp40、Hsp90a在肝癌细胞核中的高表达,初步确定了Hsp90a在肿瘤生长中的独特的重要作用。