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奶牛乳房炎是奶牛场最常见且难以根治的疾病之一,严重阻碍了奶牛业的健康发展。奶牛乳房炎病原繁多,其中无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌和停乳链球菌为常见病原。有调查表明这些细菌不仅存在于乳房炎病牛乳汁中,还可在无乳房炎临床症状的奶牛乳汁中存在。但在我国,这些细菌在健康奶牛乳汁中的存在情况还不十分清楚。原因之一是针对乳汁中这些常见乳房炎致病菌的快速、敏感、高效的检测方法仍不完善。因此,本研究对广东省大型奶牛场无临床乳房炎症状的奶样进行了乳房炎常见细菌（无乳球链菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌）的调查,并建立了针对以上细菌的多重PCR快速诊断技术及检测金黄色葡萄球菌的隔绝式恒温PCR体系,为广东省奶产品中无乳球链菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的流行病学调查提供参考和技术支撑。首先,本研究随机抽取广东省内10家大型奶牛场的460份奶样,运用染色镜检、触酶试验及细菌16s rRNA基因测序鉴定方法,进行细菌培养分离鉴定。共分离到11株无乳链球菌（2.40%）、1株停乳链球菌（0.22%）、13株乳房链球菌（2.82%）和22株金黄色葡萄球菌（4.78%）。其中,金黄色葡萄球菌的检出率最高。其次,本研究针对无乳链球菌表面免疫相关蛋白（Surface immunogenic proteins,sip）基因、停乳链球菌免疫分泌蛋白（immunogenic secreted protein,isp）基因、乳房链球菌纤溶酶原激活物A（plasminogen activactor A,pauA）基因、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（thermonuclease,nuc）基因,设计引物,并通过调节退火温度、引物浓度、Taq酶、MgC l2浓度、dNTP浓度等反应条件,建立了多重PCR检测方法。该方法对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的检测敏感性分别为105、104、105和105CFU/mL,敏感性好,且均仅可检测到相应细菌,无非特异性扩增,特异性好。另外,本研究还针对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因设计引物,并优化反应条件,建立了检测该菌的隔绝式恒温PCR检测方法。该方法仅可检测到金黄色葡萄球菌,特异性好,敏感性为1 CFU/mL,高于普通PCR(101 CFU/mL),且反应耗时明显低于普通PCR。这表明,与普通PCR相比,隔绝式恒温PCR具有敏感性更好、操作简便、耗时更短的优点。综上所述,本研究成功建立了针对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的高效、敏感、特异的多重PCR检测方法及针对金黄色葡萄球菌隔绝式恒温PCR方法,为我国奶牛乳房炎检测、乳汁品质检测提供技术支撑。本研究发现广东地区无临床乳房炎症状奶牛乳汁中存在乳房炎致病菌,与国外流行病调查结果中这些菌的检出率接近。该现象应引起广东省乃至全国奶牛乳房炎防治及乳业食品安全有关人员的关注。