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阿维菌素类(Avermectins, AVMs)药物属农畜两用杀虫剂,因其卓越的疗效目前在世界范围内被广泛应用。已有研究表明,阿维菌素类药物可对多种类群的非靶动物产生毒性效应。目前国内外有关AVMs毒理学研究主要集中在无脊椎动物和包括人类在内的哺乳动物方面,而关于鸟类AVMs毒理学的研究几乎未见报道。我们实验室的前期研究发现,美国王鸽对AVM敏感,亚慢性AVM中毒可致王鸽出现明显的中枢神经系统中毒症状,进一步的研究表明体内、外条件下AVM均可致鸽脑神经细胞呈现细胞凋亡样形态学和生化变化。应用抗鸽α-突触核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)基因的抗体检测急性AVM中毒后α-Syn基因在鸽脑组织中的表达情况时发现中毒后α-Syn基因的表达显著高于对照。已有结果表明,α-Syn基因可参与人类神经细胞凋亡的发生,进而导致神经退行性疾病。为了考察α-Syn基因的表达在AVM诱导的鸽脑神经细胞凋亡中的作用,本研究在复制鸽亚慢性AVM中毒模型、体外条件下制备鸽胚脑神经细胞AVM染毒模型的基础上,检测了鸽脑组织中凋亡相关基因、细胞因子相关基因和热休克蛋白相关基因的表达变化以及敲低α-Syn基因前后鸽胚脑神经细胞中上述指标的变化情况,探讨了α-Syn基因表达在AVM诱导的神经细胞凋亡中的作用。主要结果如下：(1)以发育7-8天的鸽胚为试验材料,采用标准方法对鸽胚脑神经细胞进行分离、提取,采用Neurobasal培养基和L-谷氨酰胺的代替产品GlutaMAX对鸽胚脑神经细胞进行了优化培养。NSE免疫细胞化学染色在优化培养后的脑神经细胞中呈强阳性反应,表明所培养的神经细胞纯度高、活性好,可用于后续各项试验指标的检测。(2)成功复制了鸽饮食性AVM亚慢性中毒模型,中毒动物表现出明显的神经症状,如站立不稳、精神沉郁、共济失调等。(3)使用Stealth RNA成功转染了原代培养的鸽胚脑神经细胞,最佳转染组合为24孔板每孔加1μLRNAi MAX和0.9μL siRNA,该组合的转染效率大于80%。筛选出鸽α-Syn基因的有效干扰序列α-Syn-Stealth (142),该序列可使鸽胚脑神经细胞中α-Syn基因mRNA表达水平降低至对照组的44%。(4)AVM对优化培养后的鸽胚脑神经细胞半数致死浓度在15-20μg/L之间。(5)应用TUNNEL和HOECHST染色法检测了AVM对鸽胚脑神经细胞的凋亡诱导情况,证实AVM能够诱导神经细胞凋亡,且呈明显的剂量-效应关系。(6)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽大脑、小脑和视叶三种脑组织和鸽胚脑神经细胞促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、cytochrome c和Bax的表达水平上调、而抑凋亡基因Bc1-2的表达水平降低,提示体内、外条件下AVM均可诱导神经细胞发生凋亡。敲低α-Syn基因后促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、cytochrome c和Bax的mRNA表达较敲低前显著降低,而抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达较敲低前显著升高,说明α-Syn基因在AVM诱导的神经细胞凋亡中起发挥重要作用。(7)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞α-Syn基因的表达水平上调；敲低α-Syn基因后该基因对AVM的敏感性显著降低。(8)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞UPP通路三种代表性水解酶：糜蛋白酶、肽基谷氨酰基水解酶和胰蛋白酶活性发生不同程度的降低,提示AVM可影响UPP通路的功能。(9)体内条件下AVM染毒可导致鸽脑组织中细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-12β、 IL-26、TNF-α和IFN-α的mRNA表达不同程度升高,IFN-γ的mRNA表达降低；体外条件下AVM染毒均可导致鸽胚脑神经细胞中细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的mRNA表达升高,IFN-γ的mRNA表达降低；敲低α-Syn基因后细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达较敲低前均显著下降。上述结果表明α-Syn基因可能介导了神经炎症的发生,进而导致细胞凋亡。(10)体内、外条件下AVM染毒可导致鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞热休克蛋白基因Hsp60、Hsp70和Hsp90的mRNA表达发生不同程度升高；敲低α-Syn基因后Hsp60、Hsp70和Hsp90的mRNA表达较敲低前均显著下调。这些试验结果表明AVM染毒诱导了鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞的适应性应激反应；敲低α-Syn基因后AVM对神经细胞的毒性作用降低,因此应激反应程度降低。综上,本研究从分子水平证明AVM可致鸽脑神经细胞发生凋亡,α-Syn基因在此过程中发挥重要作用。AVM作用后UPP通路发生障碍,导致α-Syn基因表达发生异常上调,该基因的异常上调表达即可直接诱导凋亡的发生又可经由炎症途径间接引发凋亡。此外AVM染毒还诱导了鸽脑组织和鸽胚脑神经细胞的适应性应激反应。本研究为探讨AVM致鸟类神经毒性的机理提供理论基础和试验依据。