多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种常见的以中枢神经系统(central nervous system, CNS)炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是生命科学界公认的MS动物模型。MS患者和EAE动物共同的特点是发病后存在自我缓解的现象,这是大脑限制过强免疫应答的一种自我保护作用,提示CNS中存在对脑内自身抗原进行负向免疫调控的效应。但是,负向免疫调控的关键启动细胞是什么?负向免疫调控的作用机制是什么?中枢神经系统存在特化的组织吞噬细胞称为小胶质细胞(microglia),被认为是CNS潜在的抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)。PD-L1/PD-1 (programmed cell death ligand-1/programmed death-1, PD-L1/PD-1)属于B7/CD28共刺激分子超家族的重要成员,是免疫反应效应阶段的负向调节信号通路,可通过调控T细胞的活性来诱导并维持的外周免疫耐受。研究表明,EAE发病动物CNS中PD-L1的表达逐渐增加,阻断PD-L1/PD-1信号通路造成EAE发病时间缩短并加重临床症状。由于小胶质细胞在脑组织中数量众多,且参与生理条件下的免疫赦免,那么疾病条件下它们是否表达PD-L1并通过PD-L1途径发挥免疫调节作用尚无人深入研究。为此本课题将观察小胶质细胞在MOG35-55 (myelin oligodendrocyte glycolprotein,MOG)诱导的EAE小鼠模型中数量及PD-L1表达的动态改变；明确小胶质细胞是否对T细胞具有抑制作用；探讨PD-L1分子是否具有调控小胶质细胞抑制作用的功能。本研究试图阐明小胶质细胞与EAE疾病进展和转归的关系,明确其在CNS负向免疫调控中所扮演的角色,为寻找CNS免疫性疾病的治疗靶点提供理论基础和实验依据。本研究主要包括五部分的内容：(1) MOG35-55诱发C57BL/6小鼠EAE模型的构建我们成功建立了人MS的C57BL/6小鼠EAE模型。用MOG35-55肽段并辅以结核杆菌及百日咳毒素免疫EAE敏感动物品系C57BL/6小鼠,免疫后第10天开始陆续发病,出现EAE典型的神经系统临床症状,病程为慢性单时相进展型,约在第20天达到发病高峰,同时伴随CNS组织的病理改变,HE染色检测结果发现,在脊髓白质区血管周围有大量淋巴细胞浸润,即呈“袖套样”炎性结构改变。而对照组动物始终未出现任何的神经系统症状,CNS中也未见任何病理学改变的征象。(2)动态监测EAE小鼠模型中小胶质细胞的数量、表型和活化状态采用流式细胞仪检测结果显示未处理组小鼠CNS的小胶质细胞(CD45lowCD11b+)占CD45+细胞的92.9%,EAE组小胶质细胞所占比例持续下降,高峰期比例下降至46.2%,恢复期逐渐回升。小胶质细胞绝对计数显示细胞数量呈现持续上升的趋势,与未处理小鼠比较,发病前期小胶质细胞的数量上升,但是并不明显(P>0.05),发病初期、发病中期及高峰期与未处理组对比具有统计学意义(p<0.05)。小胶质细胞的数量与疾病进展具有明显的相关性。本研究动态检测了小胶质细胞表面与抗原提呈相关的膜表面分子的表达情况,结果显示,小胶质细胞表面MHC-Ⅱ分子的表达呈进行性增加,刺激性协同刺激分子CD86表达在发病初期明显增加(p<0.05),但是在疾病中期表达恢复正常。抑制性协同刺激分子PD-L1的表达与MHC-Ⅱ分子基本一致,呈进行性增加,在发病初期、中期和高峰期均明显增加(p<0.05)。PD-L2和B7-DC变化无明显。发病初期,小胶质细胞的MHC-Ⅱ分子和CD86共表达,提示此时期的小胶质细胞具有免疫激活作用,而发病中期和高发期,MHC-Ⅱ分子和PD-L1共表达,表明此时期的小胶质细胞可发挥免疫调控作用。本研究通过免疫荧光检测技术检测EAE模型小鼠腰髓组织中Iba-1的表达来确定小胶质细胞的分布和活化情况。正常组小胶质细胞表达低量的Iba-1,主要表现为分枝状,且细胞分布分散。EAE高峰期腰髓组织各个部位表达Iba-1均增加,其中外侧索、后正中裂和前正中沟区的白质内小胶质细胞胞体变大,分支回缩消失,形态粗壮,表现为树突状及阿米巴样,胞体相互有重叠。灰质区也可见Iba-1表达增高,胞体增大,细胞密度增加,但灰质区细胞密度较白质区低,细胞分支较白质区明显。(3)动态监测EAE模型小鼠CNS中CD4+T细胞的数量、PD-1的表达及其细胞亚群本研究检测EAE模型中CNS浸润的CD4+T细胞的比例,结果显示,CD4+T细胞在临床症状出现前已进入CNS,CD4+T细胞所占CD45+细胞的比例逐步上升,高峰期比例最高,达到20.8%,随后比例下降,表明发病高峰期某种因素触发了大量T细胞凋亡,从而促进了疾病的恢复。同时流式细胞术结果显示CNS浸润的CD4+T细胞表达PD-1进行性增加,高峰期表达量最高,有统计学意义(p<0.05)。本研究同时采用了免疫组织荧光标记技术标记CD4分子和PD-1分子,结果显示,EAE高峰期的脊髓切片中可见大量CD4+/pD-1+的细胞,且细胞分布与活化小胶质细胞聚集部位相吻合,为确定小胶质细胞与CD4+T细胞存在相互作用的可能性提供了形态学依据。本实验动态监测了EAE不同时期脑和脊髓中Thl和Th17细胞的变化,结果表明,随着EAE病程的进展,IFN-7和IL-17的表达呈现逐渐升高趋势,发病中期比例达到最高,随后比例下降,提示此时效应性CD4+T细胞可能发生了凋亡。本实验同时检测了CD4+ Foxp3+调节性T的动态变化,结果显示,CD4+ Foxp3+调节性T细胞在脑中持续上升,高峰期达到最高,为34.6%,缓解期下降。本实验的数据表明EAE高峰期IL-17和IFN-y表达呈下降趋势,而Treg继续呈现聚集和扩增,说明效应性T细胞的下降和Treg细胞的上调是限制CNS过强炎症反应的基本因素。(4)利用小胶质细胞与OVA323-339抗原特异性CD4+T细胞体外共培养系统验证小胶质细胞具有免疫抑制作用小胶质细胞与OT II特异的初始CD4+T细胞共培养观察小胶质细胞对初始T细胞的抗原提呈能力,结果显示,小胶质细胞具有一定的刺激T细胞增殖的能力即具有抗原提呈功能,但是该能力显著低于脾脏DC (spleen Dendrtitic cell, spDC)的作用。同时实验数据显示小胶质细胞可诱导Thl细胞的产生,但是Th17不受影响。将小胶质细胞体外加入到spDC/CD4+T细胞共培养体系中,观察它是否能够抑制由DC刺激所引起的CD4+T细胞的增殖。在spDC/CD4+T细胞共培养体系中加入小胶质细胞后,CD4+T细胞绝对计数显著降低,表明EAE小胶质细胞能显著抑制由DC刺激引起的CD4+T细胞的增殖。同时观察该培养体系中T细胞亚群情况发现加入小胶质细胞组与单纯spDC/CD4+T细胞组比较,CD4+IFN-γ+细胞明显减少,均具有统计学意义(p<0.05),Thl7无明显变化。结果说明,EAE小胶质细胞可抑制spDC诱导的Thl细胞分化,但是不影响Th17的分化。(5)探讨小胶质细胞发挥免疫抑制作用的机制为了探讨小胶质细胞发挥免疫抑制作用的机制,我们检测了共培养体系中Treg细胞的变化,结果显示,EAE-microglia/T组的Treg细胞的比例明显高于单纯CD4+T组,具有统计学差异(p<0.05); spDC/T组加入EAE高峰期小胶质细胞后,Treg的比例明显增高(p<0.05)。结果说明小胶质细胞可通过诱导Treg细胞发挥免疫抑制作用。为了验证一氧化氮(nitric oxide, NO)是否参与了小胶质细胞的抑制作用,本课题采用实时定量PCR检测小胶质细胞一氧化氮合酶的表达情况,结果发现EAE发病高峰期小胶质细胞表达一氧化氮合酶明显高于未处理组(p<0.05),表明小胶质细胞可能通过释放NO来抑制T细胞的增殖。于是,本实验在共培养体系中加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME,以观察去除NO后,小胶质细胞的抑制作用是否得到逆转?结果发现,加入NO合酶抑制剂的确可以使CD4+T细胞的增殖得到显著恢复,提示小胶质细胞分泌的NO参与了对CD4+T细胞的抑制功能。然后,我们检测了不同处理组上清中NO的OD值,结果显示,与spDC/T组比较,在包含EAE高峰期小胶质细胞的实验组均产生大量NO(p<0.05)。因此,结果显示小胶质细胞可通过释放NO来抑制抗原特异性T细胞反应。(6)体外阻断PD-L1/PD-1途径观察小胶质细胞的免疫抑制功能在microglia/T培养体系中,加入阻断性anti-PD-L1抗体后CD4+T细胞的数量显著增加(p<0.05),同样的结果出现在microglia/spDC/T共培养体系中。但是与spDC/T比较,CD4+T细胞增殖恢复并不完全,说明PD-L1部分参与了由小胶质细胞介导的抑制作用,但是并不是全部作用都由其引起,肯定还有其他因素起作用,有待于进一步研究。为明确PD-L1是否能够影响小胶质细胞对T细胞的分化作用,本课题同样检测了阻断PD-L1后CD4+T细胞亚群的变化。实验显示,在microglia/T和microglia/spDC/T两种共培养体系中阻断PD-L1均可使Thl细胞数量显著性增加(p<0.05),表明PD-L1具有抑制Thl细胞分化的作用。无论是在microglia/T还是在microglia/spDC/T培养体系,Treg细胞的比例均无明显差异(P>0.05),表明PD-L1并不参与小胶质细胞诱导Treg细胞产生的过程。本研究检测了共培养体系上清中NO的分泌,结果显示阻断PD-L1组上清中NO检测液的OD值明显低于同型对照抗体组,提示PD-L1可通过影响小胶质细胞分泌NO而调控T细胞的增殖。综上所述,本课题研究表明EAE高峰期的小胶质细胞是一群具有免疫抑制表型和功能的免疫细胞,通过诱导Treg、分泌NO发挥免疫抑制作用。EAE高峰期小胶质细胞高表达PD-L1分子,该分子通过影响小胶质细胞分泌NO发挥免疫调控作用。本课题明确证实小胶质细胞具有免疫抑制作用,为进一步开展CNS负向免疫调控机制的研究提供了理论依据,而且为临床工作中MS的诊断和治疗提供新的思路和潜在药物作用靶点,具有重要的临床应用价值。