目的：肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae，Mp)是能在人工培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。是引起小儿下呼吸道感染的主要致病菌之一。肺炎支原体感染在世界各地均有发生，近年来，Mp感染发病率呈上升的趋势，据文献报道，Mp全球感染率达9.6％-66.7％不等，已被认为是社区获得性肺炎(CAP)的第三位病原体。Mp除引起非典型性肺炎之外，还可引起严重的肺外并发症，如脑膜脑炎、心肌炎、免疫性溶血性贫血及肾炎等，尤其在免疫低下人群中可导致严重后果，因此对其致病机制的研究日益受到人们的关注，Mp感染的致病机制主要有呼吸道上皮吸附作用、MP直接侵入和免疫学发病机制等学说，目前大多倾向于免疫学发病机制，多数研究认为MP感染可对机体产生免疫抑制，导致T细胞亚群失衡、T细胞功能低下，Th1型细胞受到抑制，但Mp感染后机体免疫的动态变化及其免疫调控作用目前尚无统一结论。　　 T细胞免疫球蛋白粘蛋白（T-cell immunoglobulin and mucin，Tim）是新近发现的表达于T细胞表面的跨膜蛋白家族。Tim-3主要表达于分化成熟的Th1细胞，Th2细胞无表达。Tim-3与广泛表达在人、小鼠脾脏和淋巴组织中的配体半乳凝素-9(galectin-9)结合，组成Tim-3/galectin-9通路，通过该途径抑制Th1细胞介导的免疫反应和诱导外周免疫耐受，是Th1免疫反应的重要负性调节因素;Mp感染后是否会导致Th1/Th2失衡，这种失衡是否与Tim-3/galectin-9通路有关？目前尚未见报道。　　 为了探讨Mp感染后机体的免疫状态以及Tim-3在Mp感染中的作用，本实验建立了Mp感染动物模型，并对Tim-3及一些相关细胞因子进行了检测，为Mp感染后机体的免疫变化及其机制的分析提供了一定的理论基础。　　 方法：　　 一、肺炎支原体FH株培养将复苏的Mp FH株接种于PPLO液体培养基，置37℃培养，根据培养基中指示剂的变化及菌落形态判定Mp生长状态。支原体浓度测定应用颜色改变单位CCU/L确定浓度。　　 二、动物分组　　 SPF级Balb/c小鼠60只，分成2组，设3、5、7、14、21天五个时间点，实验组每只鼠滴鼻接种浓度为108ccu/ml Mp菌液0.02ml，对照组接种PBS缓冲液。　　 正常对照组:用PBS做对照每个时间点5只共25只Mp感染组:用Mp感染小鼠每个时间点7只共35只三、感染动物动物麻醉后实验组小鼠经鼻腔滴鼻感染肺炎支原体，对照组小鼠用PBS滴鼻;正常饮食饮水饲养，并观察饮食饮水及精神状态。　　 四、体重变化和肺指数小鼠感染肺炎支原体后，每天准确称量小鼠体重，观察其体重变化情况并记录;无菌解剖取小鼠全肺称重，并计算肺指数。　　 五、小鼠肺组织病理变化分别于感染3d、5d、7d、14d、21d后无菌解剖取小鼠全肺，观察肺组织表面变化，取部分肺组织及气管于10％福尔马林固定后石蜡包埋、切片，HE染色后在光学显微镜下观察结果。　　 六、PCR法检测肺泡灌洗液支原体DNA取小鼠右侧肺，按常规方法制作肺泡灌洗液，部分灌洗液用酚-氯仿-异戊醇法提取DNA，PCR法扩增支原体DNA，琼脂糖凝胶电泳检测是否有肺炎支原体DNA;其余部分灌洗液用4℃离心机于1000r/min，离心20min，取上清做好标记，-20℃保存，用于细胞因子检测。　　 七、细胞因子水平测定ELISA试剂盒测定感染后细胞因子IL-4、IFN-γ含量，具体操作按试剂盒说明书进行，酶标仪测OD450值，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 八、Tim-3 mRNA表达水平测定分别于感染3d、5d、7d、14d、21d后无菌解剖取小鼠全肺及脾脏，称重后提取左侧肺组织和脾脏的mRNA，用RT-PCR方法测定Tim-3 mRNA表达水平。　　 结果：　　 一、一般情况及肺指数　　 （一）感染肺炎支原体后小鼠一般情况及体重变化接种Mp FH株的35只小鼠全部存活，感染组小鼠较对照组体温降低，食欲欠佳，精神状态差;感染后体重增长缓慢。　　 （二）肺指数　　 肺指数值升高，表示肺重量增加，肺部炎性病变程度严重;感染肺炎支原体后小鼠的肺指数明显升高，其中感染后第3d和5d升高明显，分别为2.12％和2.53％，随着病程的延长肺指数逐渐下降。　　 二、肺组织病理变化解剖实验动物时发现，感染组肺组织表面有充血和程度不同的散在出血点，镜检为急性细支气管炎伴有间质性肺炎，肺泡间隔增宽，大量的炎性细胞浸润在肺泡间隔及支气管和血管周围;对照组动物肺表面外观正常，镜检末见明显异常。　　 三、PCR法检测肺泡灌洗液支原体DNA提取小鼠肺泡灌洗液DNA，PCR扩增支原体DNA，琼脂糖凝胶电泳可见感染组小鼠在894bp处有一清晰条带即肺炎支原体DNA呈阳性，对照组为阴性。　　 四、Elisa试剂盒检测细胞因子含量感染肺炎支原体后，实验组小鼠IFN-γ于3d出现升高(p＜0.05)，5d开始受到一定程度的抑制;IL-4从3d开始升高，7d达到高峰(P＜0.05)，之后缓慢下降。　　 五、RT-PCR法测定Tim-3 mRNA表达水平肺炎支原体感染后，实验组小鼠肺组织、脾脏Tim-3 mRNA表达水平均于3d出现升高，5d达到高峰，脾脏Tim-3 mRNA表达水平于7d开始下降而肺组织则持续升高至7d。　　 结论：　　 1、小鼠感染肺炎支原体后IFN-γ和IL-4均于第3天出现升高，但从第5天开始IFN-γ受到了一定程度的抑制而IL-4则持续升高，提示肺炎支原体感染后存在Th1/Th2失衡，且Th1细胞受到抑制，以Th2介导的免疫反应为主。　　 2、肺组织和脾脏的Tim-3 mRNA表达水平均从第3天开始升高，第5天达到高峰，肺组织的Tim-3 mRNA表达水平持续升高至第7天，并且从第5天开始肺组织和脾脏Tim-3 mRNA的表达与IFN-γ呈现明显的负相关，提示Tim-3可能参与了肺炎支原体感染导致的免疫紊乱，对Th1细胞产生了负性调控作用。