番鸭IGF-I基因的全长cDNA克隆、表达及与产蛋性能的关联分析

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为研究番鸭的就巢机理,本试验选用番鸭为试验样本,选择番鸭胰岛素样生长因子1(Insulin like growth factor-1,IGF-1)基因为研究对象,通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得番鸭IGF-1基因cDNA全序列;应用多种生物信息学软件对获得的番鸭IGF-1基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行分析,并通过同源建模对翻译的蛋白质的三维结构进行预测;根据克隆所得的番鸭IGF-1基因cDNA的全长序列,针对其保守区设计特异性引物,并以鸭肌动蛋白(β-Actin)基因(EF667345.1)为内参基因,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR(RT-FQPCR)方法对IGF-1基因在非就巢期与就巢期的番鸭不同组织的差异性表达进行研究;利用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法检测番鸭IGF-1基因的多态性,并分析其多态性与番鸭产蛋性能的关联。  结果如下:  1.从番鸭肝脏中首次成功得到IGF-1基因的cDNA序列全长960bp,编码区(CDS)为462bp,编码153个氨基酸;序列比对和同源性分析显示,在核苷酸水平,该基因与灰雁(Anser)的相似度最高,为99%,与原鸡(Gallus gallus)和火鸡(Meleagris gallopavo)的同源性为98%;在氨基酸水平,与灰雁的同源性达99%;蛋白结构分析结果表明IGF-1含有1个Insulin/IGF/Relaxin family结构域,具有1个跨膜结构,使用PredictProtein在线工具进行二级结构预测发现蛋白有30.07%helix,0.65%strand,69.28%loop,同源建模得到该蛋白的三维结构。  2. IGF-1基因在番鸭肝脏中的表达最高,依次为心脏、垂体、下丘脑、卵巢、脾脏、肾脏、肺脏、胰脏、腺胃、十二指肠,在肌胃中的表达量最低。在非就巢的番鸭群体中, IGF-1基因在下丘脑、垂体、卵巢的表达高于就巢期的番鸭群体,差异极显著(P<0.01);在肝脏、心脏的表达显著(P<0.05)高于就巢期的番鸭群体。在肾脏、肺脏、肌胃、腺胃、胰脏和十二指肠中,IGF-1基因的表达量无显著差异(P>0.05)。  3.通过测序在番鸭IGF-1基因的5’端调控序列检测到1个位点的碱基突变A/G;检测出AA、GG、和AG三种基因型,不同基因型与番鸭的开产日龄和300日龄产蛋数显著相关(P<0.05),与番鸭最长连产天数和平均连产天数无显著相关(P>0.05)。
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