猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病病毒（PRRSV）引起的一种病毒性传染病,它能引起母猪流产、早产、死胎、畸形胎及仔猪、育肥猪呼吸道等症状。自1995年PRRS传入中国至今已有25年,2001年后该病开始频繁发生。尤其近几年由于我国PRRSV频繁发生变异,导致PRRSV毒株复杂多样,这使得PRRS的防控工作增加了巨大的难度。本研究为了解山东及周边地区PRRSV的流行及变异情况,对本实验室自2013年保存的2000份疑似阳性病料,利用RT-PCR方法进行检测并对确定为阳性样品进行病毒分离与鉴定,结果分离到20株PRRSV。将分离的20株PRRSV进行RNA提取并反转录成cDNA,利用12对PRRSV全长引物进行全基因组DNA序列扩增、测序和序列拼接,将拼接完成的基因序列同国内外GenBank中代表性的PRRSV参考毒株比对,从而进行基因序列同源性、系统遗传进化树、部分NSP2和ORF5基因推导的氨基酸关键位点及重组毒株分析。分析结果显示,本研究分离20株PRRSV在基因系统进化树上形成了三个大分支,即谱系8/亚系8.1（CH-1a-like）、谱系8/亚系8.7（JXA1-like）和谱系5/亚系5.1（VR-2332-like）。其中有6株与参考株VR-2332同源性最高,且与其位于同一分支,属于亚系5.1（VR-2332-like）;有1株与经典毒株CH-1a同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.3%、98.7%,且与CH-1a处于同一分支,属于亚系8.1（CH-1a-like）;有13株PRRSV它们之间核苷酸同源性为95.5%⁹9.9%,氨基酸同源性90.8%⁹8.1%,且与JXA1、HUN4等属于同一大分支,属于亚系8.7（JXA1-like）。而在NSP2遗传进化树上有5株PRRSV独立形成一小分支,在全基因组遗传进化树上1株PRRSV独立形成一小分支,这些小分支处于谱系5和8之间,这提示可能存在基因重组现象。NSP2基因推导氨基酸发现,本研究分离株中属于亚系8.7的13株PRRSV与高致病性代表株JXA1具有相同的30个不连续氨基酸缺失特征,其中有4（SDGM-7-3-2016、SDJY-2017、SDLC-23-2015、SDRZ-10-12-2015）存在5处（422aa、465aa、502aa、590aa、605aa）一致性突变;属于亚系8.1中的1株与CH-1a相比,发生了4个氨基酸突变（396aa、461aa、482aa、514aa）和1个氨基酸缺失（632aa）;位于亚系5.1大分支的HBHD-2017与VR-2332相比基本一致,而SDWF-p8-3-2014出现了4个氨基酸缺失（503aa,595⁵97aa）,另外4株具有高致病性30个不连续氨基酸缺失特征,这进一步说明了它们可能是在NSP2区域发生了基因重组。ORF5基因推导氨基酸发现,所有分离株主要表现为氨基酸的突变。其中在病毒毒力相关位点,位于亚系5.1分离株中除HBHD-2017由R¹⁵¹→I¹⁵¹外,其余分离毒株均由R¹³→Q¹³,R¹⁵¹→K¹⁵¹;而位于亚系8.1和亚系8.7的分离株均表现为强毒株特征R¹³、R¹⁵¹。在区分疫苗株与野毒株的第137位氨基酸,亚系5.1的6株PRRSV与VR-2332、RespPRRS MLV疫苗株相同为A,这表明它们很可能是来源于弱毒活疫苗株的毒力返强毒株。此外,在与中和抗体结合有关的第39位氨基(F/L³⁹),亚系5.1分离株表现为L³⁹,亚系8.1分离株为F³⁹,亚系8.7分离株为I³⁹,这些氨基酸的变化可能会使病毒产生免疫逃避从而影响其对宿主细胞的感染能力。通过N-糖基化位点分析,所有分离株在44⁴6aa、51⁵3aa N-糖基化位点依然高度保守。而位于亚系5.1分离株与VR-2332相比在33³5aa,34³6aa存在不同糖基化位点丢失和增加;位于亚系8.1的1株分离株与CH-1a相比未发生变化;位于亚系8.7分离株与JXA1相比2株在33³5aa和34³6aa增加了糖基化位点,在35³7aa丢失了糖基化位点,另外有3株在30³2aa丢失了糖基化位点,这些N-糖基化位点数目变化可能会影响病毒毒力,从整个亚系8.7分离株时间来看,N-糖基化位点有逐渐向中和抗原表位移动的趋势,进而遮蔽中和抗原表位,导致疫苗免疫失败。基因重组分析显示,在20株分离株中有7株存在基因重组现象,其中1株重组模式是由VR-2332、JXA1、CH-1a组成,其余6株均由VR-2332和JXA1组成。将本研究分离重组株与其他研究团队在2013至2018年期间分离的重组毒株相比较发现,它们重组断裂位点并没有特定的分布区域而是随机分布在整个基因组中,其中高频区位于NSP2、NSP9、ORF2、ORF4、ORF7,在其他区域偶有发生。以上研究结果表明,2013至2018年期间山东省及周边部分地区猪群中HP-PRRSV依然为优势毒株,且经典毒株也有存在。NSP2和GP5基因分析发现,PRRSV随着时间发展,它的基因不断地发生新的变异,主要表现为病毒基因的突变和缺失。又通过重组毒株分析发现当前普遍使用PRRSV减毒活疫苗情况下,有越来越多的毒株是从疫苗病毒演变而来并发生基因重组,这大大增加了毒株变异的概率。为此,进一步了解和探究PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学情况显得尤为重要。此次研究将有助于了解山东省及周边地区PRRSV的遗传变异规律,丰富山东部分地区和周边地区流行病学数据,为PRRSV疫苗毒株的筛选提供理论依据。