研究背景：　　镉是环境中广泛存在的一类有毒重金属，是明确的第一类人类致癌物。肺癌、前列腺是最早被证实与职业镉暴露相关的恶性肿瘤。近年来，越来越多人群流行病学和实验研究表明慢性低浓度镉暴露与多种恶性肿瘤的发生有关。　　鼻咽癌是一种来源于鼻咽上皮组织的恶性肿瘤，发病具有明显的地域、种族和性别分布不平衡特点。遗传易感性、EB病毒、饮食与环境因素是鼻咽癌发生的主要原因，目前较明确的鼻咽癌化学致癌物仅限于亚硝酸胺类、多环芳烃类及镍。放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，然而肿瘤细胞产生放疗抵抗是治疗失败的重要原因之一。肿瘤的放疗抵抗机制复杂，现有研究鲜有关注环境暴露对肿瘤放射敏感性个体差异的影响。低剂量镉暴露被发现可降低化疗药物5-氟尿嘧啶对乳腺癌细胞的毒性作用,镉暴露是否还增加肿瘤细胞对放疗抵抗的能力，目前尚无报道。　　Wnt/β-catenin通路在鼻咽癌细胞增殖、侵袭迁移及放疗抵抗中发挥重要作用，同时也是介导镉致肾癌的重要信号通路，但镉具体通过何种机制调控Wnt/β-catenin通路并不清楚。一些Wnt通路负性调控分子启动子区甲基化引起的基因沉默可诱导通路异常活化。甲基化修饰是镉致癌的分子机制之一，慢性镉暴露是否通过改变Wnt/β-catenin通路特定负调控组分如酪蛋白激酶1α（CK1α）的DNA甲基化状态致蛋白表达下降，诱导通路活化继而促进鼻咽癌的恶性进展和放疗抵抗，值得探索。　　本课题组前期病例-对照研究显示，机体血镉负荷是鼻咽癌的危险因素，且血镉水平与肿瘤临床分期和淋巴结转移呈正相关，提示镉暴露可能促进鼻咽癌的发生、发展。在此基础上，本研究将通过CNE-1、CNE-2细胞株在含1 μM 氯化镉（CdCl2）的培养基中持续培养10周建立慢性低浓度镉暴露鼻咽癌细胞模型（CCT-CNE1和CCT-CNE2细胞），采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、克隆形成实验、Transwell实验、蛋白质免疫印迹（WB）、免疫荧光染色、放射照射、裸鼠皮下成瘤、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、双荧光素酶报告基因和甲基化特异性PCR（MSP）等技术手段，观察细胞增殖、侵袭迁移、上皮间质转化（EMT）、细胞骨架、放射敏感性、移植瘤生长曲线以及Wnt/β-catenint信号通路调控等指标，探讨慢性低浓度镉暴露对鼻咽癌恶性表型和放射敏感性的影响，为鼻咽癌的病因学与放疗抵抗研究以及个体化治疗提供新思路。　　研究背景：　　镉是环境中广泛存在的一类有毒重金属，是明确的第一类人类致癌物。肺癌、前列腺是最早被证实与职业镉暴露相关的恶性肿瘤。近年来，越来越多人群流行病学和实验研究表明慢性低浓度镉暴露与多种恶性肿瘤的发生有关。　　鼻咽癌是一种来源于鼻咽上皮组织的恶性肿瘤，发病具有明显的地域、种族和性别分布不平衡特点。遗传易感性、EB病毒、饮食与环境因素是鼻咽癌发生的主要原因，目前较明确的鼻咽癌化学致癌物仅限于亚硝酸胺类、多环芳烃类及镍。放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，然而肿瘤细胞产生放疗抵抗是治疗失败的重要原因之一。肿瘤的放疗抵抗机制复杂，现有研究鲜有关注环境暴露对肿瘤放射敏感性个体差异的影响。低剂量镉暴露被发现可降低化疗药物5-氟尿嘧啶对乳腺癌细胞的毒性作用,镉暴露是否还增加肿瘤细胞对放疗抵抗的能力，目前尚无报道。　　Wnt/β-catenin通路在鼻咽癌细胞增殖、侵袭迁移及放疗抵抗中发挥重要作用，同时也是介导镉致肾癌的重要信号通路，但镉具体通过何种机制调控Wnt/β-catenin通路并不清楚。一些Wnt通路负性调控分子启动子区甲基化引起的基因沉默可诱导通路异常活化。甲基化修饰是镉致癌的分子机制之一，慢性镉暴露是否通过改变Wnt/β-catenin通路特定负调控组分如酪蛋白激酶1α（CK1α）的DNA甲基化状态致蛋白表达下降，诱导通路活化继而促进鼻咽癌的恶性进展和放疗抵抗，值得探索。　　本课题组前期病例-对照研究显示，机体血镉负荷是鼻咽癌的危险因素，且血镉水平与肿瘤临床分期和淋巴结转移呈正相关，提示镉暴露可能促进鼻咽癌的发生、发展。在此基础上，本研究将通过CNE-1、CNE-2细胞株在含1 μM 氯化镉（CdCl2）的培养基中持续培养10周建立慢性低浓度镉暴露鼻咽癌细胞模型（CCT-CNE1和CCT-CNE2细胞），采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、克隆形成实验、Transwell实验、蛋白质免疫印迹（WB）、免疫荧光染色、放射照射、裸鼠皮下成瘤、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、双荧光素酶报告基因和甲基化特异性PCR（MSP）等技术手段，观察细胞增殖、侵袭迁移、上皮间质转化（EMT）、细胞骨架、放射敏感性、移植瘤生长曲线以及Wnt/β-catenint信号通路调控等指标，探讨慢性低浓度镉暴露对鼻咽癌恶性表型和放射敏感性的影响，为鼻咽癌的病因学与放疗抵抗研究以及个体化治疗提供新思路。　　研究目的：　　从细胞学和动物实验水平阐明慢性低浓度镉暴露与鼻咽癌发生、发展及放疗抵抗的关系，探讨CK1α甲基化在镉暴露鼻咽癌细胞Wnt/β-catenin信号通路调控和恶性生物学行为及放疗抵抗中的作用。　　材料与方法：　　·细胞模型构建：以CdCl2作为暴露物质，鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2在1μM浓度作用下持续暴露10周，构建慢性低浓度镉暴露鼻咽癌细胞模型。　　·细胞生物学行为研究：采用MTT法、克隆形成实验分别测定细胞增殖、克隆形成能力；利用Transwell实验检测细胞侵袭、迁移情况；应用Western blot测定EMT相关标志物钙黏蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-cadherin和波形蛋白（Vimentin）；采用免疫荧光染色观察细胞骨架纤维状肌动蛋白（F-actin）的定位和结构；利用裸鼠皮下移植瘤模型评价细胞体内成瘤能力。　　·放射敏感性研究：将各组细胞予0、2、4Gy 放射照射后，采用MTT和克隆形成实验分别测定细胞对放射照射的敏感性；采用10Gy一次性照射暴露组和对照组细胞的裸鼠移植瘤，比较照射后瘤体生长情况。　　·分子机制研究：应用Western blot和免疫荧光染色分析β-catenin、CK1α的表达及胞内分布；应用RT-PCR测定Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因c-myc、C-jun、cyclin D1和 cyclin E 的 mRNA 水平；采用 TOP-Flash/FOP-Flash 双荧光素酶报告基因检测Wnt/β-catenin通路活性；利用MSP测定CK1α启动子区甲基化状态；应用去甲基化试剂5-aza-CdR处理暴露组细胞，分别应用Western blot和RT-PCR测定β-catenin、CK1α蛋白表达及下游靶基因的转录情况，进一步通过MTT、Transwell实验、放射照射后克隆形成实验分析去甲基化干预对逆转镉暴露鼻咽癌细胞恶性生物学表型及放疗抵抗的作用。　　·统计分析；运用SPSS 19.0统计软件，计量资料采用均数 ±标准差（-x ±s）表示，两组间均数比较采用两独立样本的 t 检验，多组间均数间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。以P<0.05作为差异显著的判断标准，采用GraphPad Prism 5.0软件制图。　　结果：　　·成功构建稳定生长的慢性低浓度镉暴露鼻咽癌细胞模型CCT-CNE1和CCT-CNE2。　　·慢性低浓度镉暴露促进鼻咽癌细胞恶性生物学行为：MTT和克隆形成实验结果表明，与无镉暴露的亲代细胞CNE-1、CNE-2比较，暴露组CCT-CNE1和CCT-CNE2细胞的增殖率、克隆形成率均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Transwell侵袭和迁移实验显示，暴露组的侵袭和迁移能力均显著高于对照组，差异均有统计学意义 (P <0.01)。Western blot结果表明，暴露组上皮型标志物E-cadherin表达下降，间质型标志物N-cadherin、Vimentin表达增加。免疫荧光染色显示，暴露组骨架蛋白F-actin荧光信号增强，网格状应力纤维增粗、极向分布，伪足增多。裸鼠皮下成瘤实验表明CCT-CNE1细胞的移植瘤生长速度显著高于CNE-1移植瘤组（P<0.05）。　　·慢性低浓度镉暴露增强鼻咽癌细胞放疗抵抗：MTT和克隆形成实验结果表明，暴露组细胞接受2、4Gy放射照射后细胞相对活性和存活分数均显著高于对照组（P<0.05）；移植瘤放射照射实验显示从照射后第6天开始CCT-CNE1与CNE-1移植瘤生长曲线有显著性差异（P<0.05）。　　·慢性低浓度镉暴露诱导Wnt/β-catenin信号通路活化和CK1α甲基化：Western blot结果表明，暴露组细胞β-catenin表达上调、CK1α表达下降。免疫荧光染色进一步显示暴露组β-catenin除整体荧光信号增强外还发生核转位。RT-PCR结果显示，暴露组细胞c-Myc、C-jun、cyclin D1和cyclin E的mRNA水平显著高于对照组（P<0.001）。双荧光素酶报告基因测定表明CCT-CNE1的荧光素酶活性是CNE-1的3.11倍，差异有统计学意义（P<0.05）。MSP检测暴露组CK1α甲基化程度高于对照组。　　·去甲基化抑制Wnt/β-catenin信号通路及细胞恶性表型，增加放射敏感性：Western blot显示CCT-CNE1去甲基化处理导致CK1α蛋白表达增加，β-catenin蛋白下降，RT-PCR结果表明及c-myc、C-jun、cyclin D1和cyclin E mRNA水平显著下降（P<0.001）。此外，功能学研究提示去甲基化可显著抑制细胞增殖、侵袭和迁移能力（P<0.01），显著增加放射敏感性（P<0.01）。　　结论：　　慢性低浓度镉暴露可通过诱导CK1α DNA甲基化激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进鼻咽癌细胞生长、侵袭转移及放疗抵抗，机体镉负荷应作为放疗措施制定的考虑因素之一。