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体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术是牛体外胚胎生产(in vi(?)ro embryoproduction,IVEP)的关键环节之一,该技术应用于奶牛性控胚胎的生产和优良肉牛品种的快速繁育有着巨大的商业前景。目前牛胚胎的体外生产技术已得到很大提高,但是还存在着生产效率较低、培养体系不稳定、体外胚胎质量不高、移植妊娠率较低等问题。本研究利用屠宰场大量的废弃黄牛卵巢,对影响牛IVF胚胎生产效率的主要环节进行了系统的研究,旨在优化牛IVEP程序,建立起一套高效的牛体外胚胎生产体系。研究结果如下:(1)体外成熟(in vitromaturatiom,IVM)22-24h后,对卵母细胞外包裹的卵丘细胞分别进行全脱除(裸卵)、部分脱除和全保留的处理,受精后发现三组间卵裂率分别为46.8%、77.7%和78.9%;囊胚率分别为7.7%、24.2%和25.6%;囊胚孵化率分别为12.5%、62.5%和68.9%。裸卵受精卵裂率、囊胚率和囊胚孵化率均极显著低于有卵丘细胞包裹的卵母细胞(P＜0.01)。(2)采用不同大小的微滴(20μl、50μl和80μl)培养牛IVF胚胎,各组卵裂率分别为86.4%、80.5%和76.0%,差异不显著(P＞0.05);囊胚率分别为35.0%、36.4%和28.2%,差异不显著(P＞0.05);囊胚孵化率分别为63.3%、62.5%和51.8%,在20μl组和50μl组之间差异不显著(P＞0.05),但均显著高于80μl组(P＜0.05)。(3)分别以CR1和SOF为牛IVF胚胎培养基础液,两组卵裂率分别为82.9%vs.79.1%;囊胚率分别为35.2%vs.30.9%;囊胚孵化率分别为71.9%vs.69.6%,差异均不显著(P＞0.05),CR1组稍高于SOF组。结果发现,CR1和SOF两种基础液都能支持牛体外受精胚胎获得很好的发育能力,但CR1基础液的效果略好于SOF。(4)牛IVF胚胎培养液为CR1,2天后添加5%FBS,与CR1+5%FBS全程培养相比,前者卵裂率显著低于后者(71.8%vs.81.9%,P＜0.05),两组囊胚率和囊胚孵化率差异均不显著(P＞0.05);若前3天培养液为CR1+3mg/ml BSA,后换成CR1+5%FBS,与CR1+5%FBS全程培养相比卵裂率无显著差异(84.5%vs.79.9%,P＞0.05),囊胚率显著提高(30.9%vs.23.8%,P＜0.05)。结果表明,培养前期添加3mg/mlBSA,后期添加5%FBS的二步培养法更有利于牛IVF胚胎的发育。(5)从培养的第0、2、3和5天开始培养液中添加5%FBS,牛IVF胚胎囊胚发育率分别为23.4%、27.7%、34.2%和35.5%。第3天和第5天添加FBS对囊胚率无显著影响,第2天添加FBS组的囊胚率高于第0天添加组,但差异不显著(P＞0.05)。第3天或第5天添加FBS与第0天或第2天添加组相比,显著提高了囊胚发育率(P＜0.05)。结果表明,从培养的第3天或第5天添加FBS牛IVF胚胎的发育潜力更好。(6)在胚胎培养的第3天,培养液中添加不同浓度的FBS(5%、10%和20%),囊胚率分别为35.6%、34.6%和27.0%,5%和10%血清组囊胚率高于(?)0%血清组,但差异不显著(P＞0.05);囊胚孵化率分别为70.4%、68.3%和55.4%,20%血清组囊胚孵化率显著降低(P＜0.05)。结果显示,在胚胎培养的第3天添加5%FBS效果最佳。(7)培养液中分别添加1mg/mlPVA、3mg/mlBSA和5%FBS,囊胚率分别为18.3%、24.2%和31.9%,囊胚孵化率分别为21.7%、44.3%和62.1%,FBS组显著高于BSA组(P＜0.05),极显著高于PVA组(P＜0.01);BSA组显著高于PVA组(P＜0.05)。结果表明FBS作为蛋白质来源的培养效果优于BSA,不添加蛋白质(PVA组)不利于胚胎的发育。(8)胚胎培养液中分别添加0、1、10和100 ng/ml的leptin,各组卵裂率无显著差异(P＞0.05);囊胚率分别为30.7%、31.5%、36.8%和26.3%,leptin浓度为10ng/ml时囊胚率显著高于100ng/ml组(P＜0.05),其余各组间无显著差异;各组囊胚孵化率无显著差异(P＞0.05)。结果表明胚胎培养液中添加10ng/ml的leptin为宜。综上所述,牛卵母细胞体外受精前全保留卵丘细胞,体外受精胚胎的基础培养液选择CR1aa,从培养的第3或5天添加5%的FBS和添加10ng/ml的瘦素对牛体外胚胎生产效率最高。