论文部分内容阅读
随着抗菌药长期广泛使用,肠杆菌科鸡源分离菌对药物的耐药率逐年升高,且呈多重耐药趋势。导致细菌获得多重耐药的因素有很多,其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ- lactamases,ESBLs)和整合子被证实常参与细菌多重耐药的形成。为此,做了以下研究:(一)利用VITEK-32全自动细菌鉴定仪对从河南省14个地市不同养鸡场分离的64株鸡源分离菌进行鉴定,获得51株鸡源大肠杆菌、8株鸡源沙门菌、4株鸡源奇异变形杆菌和1株鸡源鲍曼不动杆菌,其中鸡源鲍曼不动杆菌为国内外首次分离。采用微量稀释法测定64株鸡分离菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、氟喹诺酮类和磺胺等六类共24个药物或组合的多重耐药表型。结果发现58.8%~74.5%的鸡源大肠杆菌对三代头孢耐药,96%(49/51)为四重及以上耐药菌株,92.2%(47/51)呈五重及以上耐药,82.4%(42/51)呈六重及以上耐药。8株鸡源沙门菌的多重耐药谱均不低于四重,且其中两株菌呈现出同时耐12重药物。其他五株分离菌的耐药谱均低于3重(其中Dpro为五重耐药除外),且均对三代头孢敏感。(二)ESBL检测结果表明54.7%(35/64)受试菌为产ESBL菌。利用PCR法检测64株受试菌携带β-内酰胺酶基因情况,结果发现38株携带TEM基因,包括TEM-1亚型37株,TEM-57亚型1株,其中TEM-57亚型为首次在鸡源分离菌中检出。19株携带CTX-M基因,包括14株CTX-M-65,1株CTX-M-14,3株CTX-M-24和1株CTX-M-90,其中CTX-M-90为首次发现并命名的一个新基因亚型,CTX-M-65亚型为首次在动物源分离菌中检出。由此得出CTX-M基因突变过程为CTX-M-14→CTX-M-24或CTX-M-90→CTX-M-65。21株携带OXA基因,包括11株OXA-1,2株OXA-2和16株OXA-10。说明TEM-1是目前河南省养鸡场鸡源分离菌中的主要基因亚型,其次为OXA-10、CTX-M-65和OXA-1。(三)分析产ESBL菌和非产ESBL菌携带β-内酰胺酶基因情况和多重耐药谱。结果发现74.3%产ESBL菌(26/35)同时携带两种以上β-内酰胺酶基因,而仅6.9% (2/29)非产ESBL菌同时检出2种β-内酰胺酶基因。在35株产ESBL菌中,100%耐氨苄西林,对三代头孢的耐药率为77.1%~91.4%,对三代头孢/酶抑制剂联用的耐药率为0~37.1%,同时,产ESBL菌的多重耐药谱均不低于六重,其中94.3%(33/35)为七重及以上耐药菌株。而非产ESBL菌对β-内酰胺类的耐药率均低于45%(氨苄西林除外),44.8% (13/29)的多重耐药谱不低于6重,仅20.7%(6/29)不低于七重。比较产酶菌ESBL基因型与多重耐药谱关系后发现47.4%(9/19)产CTX-M-ESBL菌多重耐药谱不低于十重,而在16株非产CTX-M-ESBL菌中,仅18.8%(3/16)不低于十重。同时还发现在15株产CTX-M-65或CTX-M-90菌株中,60%(9/15)多重耐药谱超过10重,20%(3/15)为12重;而4株携带CTX-M-14或CTX-M-24菌株多重耐药谱均低于10重。即携带CTX-M-65或CTX-M-90的菌株对受试药物耐药性较携带CTX-M-14或CTX-M-24菌株严重,提示CTX-M基因亚型的突变趋势与细菌耐药表型扩大延伸方向基本一致。(四)采用1/2 MIC头孢曲松或头孢噻肟诱导培养5株非产ESBL鸡源大肠杆菌和O78。结果发现培养至10代时,头孢曲松或头孢噻肟的MIC值升高了8~64倍;培养至20代时,两药的MIC值又升高了2~16倍,其中头孢噻肟诱导的O78已对头孢噻肟耐药;培养至30代时,诱导菌对头孢曲松、头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、多西环素、氟苯尼考和恩诺沙星均耐药。说明在单一抗菌药定向选择性压力下,细菌表达多重耐药表型的速度是较快的。(五)经PCR检测及测序分析,未诱导前O78为TEM-1型,头孢噻肟诱导至20代时,TEM序列发生一处碱基变异(24T→C);诱导至30代时,TEM-1序列发生两处碱基变异(24T→C,40C→T),其中后一处碱基突变引起14Pro→Ser,即TEM-1基因可直接突变为一个新基因亚型,说明药物定向诱导对菌株TEM基因变异起了重要作用。未诱导前,受试菌均不携带CTX-M基因,诱导至20代时,头孢噻肟诱导O78已突变为CTX-M-14-ESBL菌株;诱导至30代时,所有诱导菌株均成为CTX-M-ESBL(CTX-M-90和CTX-M-65)菌株,说明在三代头孢定向选择性压力下,CTX-M型基因具有较快变异速度。分析各CTX-M基因序列推断出CTX-M基因突变过程:非产ESBL菌首先获得CTX-M-14基因,接着该基因发生氨基酸点突变成为CTX-M-90,然后CTX-M-90基因进一步积累氨基酸点突变,菌株获得CTX-M-65基因,随着诱导的深入,CTX-M-65基因也开始出现碱基突变,但由于该突变仅为沉默突变,故暂时未有新基因亚型产生。此外,本诱导试验获得的CTX-M基因亚型均在前期鸡源分离菌检测时有检出,说明本诱导试验的推断出的CTX-M基因突变过程可在一定程度上反映出临床菌实际的突变过程,诱导药物与临床菌实际接触的药物相似。(六)利用PCR技术检测51株鸡源大肠杆菌中整合子流行情况。结果表明86.3%(44/51)检出Ι类整合子,3.9%(2/51)检出Ⅱ类整合子,未检出Ⅲ类整合子和非典型Ι类整合子。基因盒插入区片段经克隆、测序和比对后发现在44株Ι类整合子中耐药基因盒组合类型包括sat(100%)、dfrA1/aadA1(45.4%)、dfrA17/aadA5(22.5%)、dfrA1/sat/aadA2(6.8%)和约4800 bp的未知基因盒(27.3%),其中dfrA1/sat/aadA2基因组合为国内外首次报道。进一步采用巢式PCR和PCR定位技术检出4800 bp未知基因盒内含有blaCTX-M基因,且该基因位于基因盒区的中下游。两株Ⅱ类整合子阳性菌中检出的耐药基因盒组合均为dfrA1/sat1/aadA1。(七)分析鸡源大肠杆菌整合子与ESBL的关系后发现93.6%产ESBL鸡源大肠杆菌(29/31)携带整合子,而在20株非产ESBL鸡源大肠杆菌中,此数值为75%,两组之间的差异具有统计学意义,说明整合子在产ESBL鸡源大肠杆菌中分布更为集中。在15株携带整合子的非产ESBL菌中,80%菌株(12/15)携带一种整合子,且整合子的可变区仅整合了一种耐药基因;而对29株携带整合子的产ESBL菌来说,有89.6%菌株(26/29)携带2~4种整合子。