【摘 要】
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免疫亲和层析是一种非常有效的生物大分子纯化方法,特别是应用在纯化过程的第一步.该论文根据卵黄免疫球蛋白(IgY)产量大、易于分离等特点,将其作为免疫亲和配基分离相应抗原.选用长白山白眉蝮蛇蛇毒中的Gln49磷脂酶A(Gln49-PLA)为抗原免疫产蛋鸡,收集鸡蛋,以天数和ELISA数值(OD值表示IgY相对活性)为坐标绘制免疫滴定曲线,结果表明三次加强免疫后可持续获得抗体,在免疫后51天相对活性达
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免疫亲和层析是一种非常有效的生物大分子纯化方法,特别是应用在纯化过程的第一步.该论文根据卵黄免疫球蛋白(IgY)产量大、易于分离等特点,将其作为免疫亲和配基分离相应抗原.选用长白山白眉蝮蛇蛇毒中的Gln49磷脂酶A<,2>(Gln49-PLA<,2>)为抗原免疫产蛋鸡,收集鸡蛋,以天数和ELISA数值(OD值表示IgY相对活性)为坐标绘制免疫滴定曲线,结果表明三次加强免疫后可持续获得抗体,在免疫后51天相对活性达到最高(0.654),一年后抗体的相对活性维持在0.614,证明特异性抗体的含量至少在一年内基本不变.几种PEG6000沉淀法粗分IgY的结果显示卵黄液采用PEG6000-乙醇沉淀法,得到的IgY纯度最高,特异活性强,卵磷脂去除较彻底,利于长期保存;用偶联Gln49-PLA<,2>的Sepharose 4 Fast Flow的亲和介质从卵黄液中一步分离得到特异性抗体,抗体活性提高39倍;以抗Gln49-PLA<,2>-Sepharose 4 Fast Flow的特异性IgY重复上样,收集相应组分,根据Langmuir-type吸附等温曲线,测定免疫亲和介质的最大载量q<,m>为0.59mg/mlgel,解离常数K<,d>为4.4×10<-5>mg/ml;Western-blot显示抗原与抗体特异性结合.以抗Gln49-PLA<,2>特异性IgY为配基偶联到溴化氰活化的Sepharose 4 Fast Flow介质上,一步分离长白山白眉蝮蛇粗毒中的Gln49-PLA<,2>,所得目的蛋白纯度高达95%,回收率大于83%,产率约为13%,与实验室四步分离Gln49-PLA<,2>相比,步骤简单,产率提高6.5倍;Anti-Gln49-PLA<,2>-IgY-Sepharose 4 Fast Flow亲和介质的最大载量q<,m>为0.49mg/ml gel,解离常数K<,d>为1.66×10<-7>mg/ml,表明以anti-Gln49-PLA<,2>特异性IgY为配基时不需要苛刻的洗脱条件,是比较理想的生物亲和配基;配基使用60次后,性质仍保持稳定无泄漏情况发生.以Anti-Gln49-PLA<,2>特异性IgY作为配基纯化大肠杆菌中表达的重组Gln49-PLA<,2>,目的蛋白纯度从4.98%提高到11.5%.
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