背景与目的:急性与慢性胰腺炎都是以腹痛为主要特征的胰腺炎症性疾病,严重情况下甚至危及生命。目前临床上治疗胰腺炎以对症支持治疗为主,尚无临床特效药。由于胰腺特殊的解剖位置,因此胰腺炎的发病机制与治疗等相关研究面临诸多障碍,大部分理论基础来源于实验动物模型的研究。为了更好地研究胰腺炎的发病机制以及探索有效的预防和治疗措施,需构建临床相关的胰腺炎动物模型。雨蛙素,目前广泛使用一种胆囊收缩素（CCK）类似物,在啮齿类动物中诱导胰腺炎模型。然而有报道人体内胰腺腺泡细胞上没有CCK受体的功能,因此雨蛙素诱导的胰腺炎模型与人类疾病的相关性颇受质疑。毒蕈碱乙酰胆碱受体3（M3受体）在人体内胰腺腺泡细胞中高度表达,其与CCK受体均属于Gq蛋白偶联受体,这两种受体的激活对分离的小鼠胰腺腺泡细胞产生类似的生物学效应,包括钙离子与PKC信号通路激活、淀粉酶分泌、形态学变化、乳酸脱氢酶释放等。最直接的证据发现体内暴露于强胆碱能激动剂与人类急性胰腺炎的发生有关,如蝎子咬伤或有机磷中毒。胆碱能受体拮抗剂阿托品能改善酒精与雨蛙素联合诱导的胰腺炎,提示胆碱能通路参与了胰腺炎的发生过程。由于乙酰胆碱激活的M受体在人体内分布广泛,通过传统药理学来研究胰腺腺泡M3受体在胰腺炎发病机制中的具体作用存在困难。本研究通过利用一项基于GPCRs设计的毒蕈碱受体（DREADDs）,这些设计受体无法结合内源毒蕈碱受体激动剂乙酰胆碱,可以被氯氮平-N-氧化物（CNO）这种化合物有效地激活。因此,我们通过制定特异激活胰腺腺泡细胞M3受体的措施,从而探讨其在胰腺炎发生过程中的作用及机制。材料与方法:（一）对比人体内胰腺腺泡细胞中不同的M受体与CCK受体的表达与功能1、通过RNA测序与RT-PCR方法检测正常人体内胰腺腺泡细胞中M受体与CCK受体不同亚型的m RNA表达情况。2、观察M受体激动剂卡巴胆碱与CCK受体刺激物CCK-8对人体正常胰腺腺泡细胞的功能反应,包括淀粉酶的释放以及细胞形态改变。（二）构建胰腺特异性表达的突变M3受体小鼠模型,探讨M3受体在胰腺损伤的作用。1、通过构建带有胰腺弹力蛋白酶启动子的Cre ERT融合基因的小鼠与带Lox P-stop-Lox P环的人源的突变M3受体（h M3）的杂交小鼠（h M3/BAC）,在他莫昔芬诱导后,验证小鼠胰腺腺泡细胞中h M3受体的表达。2、用CCK-8、卡巴胆碱、CNO刺激分别刺激对照BAC与h M3/BAC小鼠分离的胰腺腺泡细胞,对比CCKA受体、小鼠内源的M受体以及h M3受体刺激后腺泡细胞功能反应,包括淀粉酶的释放以及细胞形态改变。3、探索不同剂量的CNO腹腔注射（分别是0、1、2、4、6、8、10、20mg/kg共5次（1次/小时））（n=3）,通过h M3受体的激活诱导AP的发生。基于不同剂量的结果趋势变化,选6mg/kg剂量的CNO不同次数的刺激h M3/BAC小鼠（n=3）,选择有效剂量CNO构建AP模型。4、通过CNO注射h M3/BAC小鼠构建AP模型,对比BAC和h M4/BAC小鼠胰腺水肿程度、血清淀粉酶水平以及胰腺病理损伤,通过中性粒细胞（CD11b）和巨噬细胞（F4-80）免疫组化染色观察炎症细胞侵润。5、观察胰腺h M3受体激活引起自噬功能变化的情况。6、选用Pdx1启动子介导Cre酶的表达,观察CNO诱导h M3/Pdx1小鼠的胰腺水肿程度、血清淀粉酶水平、炎症侵润以及胰腺病理损伤。7、对比CNO刺激小鼠M3受体模型与雨蛙素诱导的AP,选BAC小鼠给予超大剂量的雨蛙素100μg/kg 8次（1次/小时）腹腔注射,BAC、h M3/BAC以及h M3/Pdx1小鼠通过单次6mg/kg CNO处理。比较胰腺组织水肿、血清淀粉酶、胰腺组织病理、免疫组化凋亡检测指标Cleaved Caspase-3（C-caspase-3）染色以及坏死检测指标HMGB1染色。（三）探讨NF-κB通路的激活参与M3受体诱导AP的过程以及通过IKKβ调节NF-κB通路对AP预后的影响1、观察刺激胰腺M3受体诱导AP模型中NF-κB信号通路的激活情况,对比雨蛙素诱导AP以及生理盐水组,检测IκBα和磷酸化p65（Ser 536）水平以及免疫组化蛋白定位胰腺中p65蛋白分布。2、激活小鼠M3受体后观察NF-κB下游许多炎症因子如MCP1、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA水平变化。3、为进一步探讨NF-κB通路与胰腺炎预后的关系,通过调控NF-κB通路上游关键蛋白IKKβ观察对激活M3受体诱发胰腺炎的影响。条件性转基因IKKβ小鼠与胰腺特异性Cre小鼠杂交后给予他莫昔芬诱导,通过在BAC与IKKβf/f/BAC小鼠注射雨蛙素,给予h M3/BAC、IKKβf/+/h M3/BAC与IKKβf/f/h M3/BAC小鼠CNO处理,用生理盐水处理作为对照,观察AP严重程度相关指标。4、观察特异性IKKβ抑制剂TPCA-1对雨蛙素诱导AP模型与CNO诱导h M3/BAC小鼠AP模型中胰腺损伤及炎症的影响。（四）反复刺激M3受体诱导慢性胰腺炎的特征1、在AP早期尤其是在CNO刺激h M3/BAC小鼠中可观察到TGF-β与α-SMA的m RNA水平明显上调,提示可能向慢性炎症过程进展。通过雨蛙素或刺激M3受体诱导AP模型,观察一周内胰腺病变的进展与恢复情况以及慢性炎症过程。2、由于胰腺中M3受体的激活相比雨蛙素模型表现出更严重的AP特征,其恢复过程更慢。于是推测h M3受体小鼠诱导的胰腺炎更容易慢性化。为了验证这一假设,每隔一天,在BAC小鼠中通过多次注射雨蛙素或在h M3/BAC和h M3/Pdx1小鼠中注射一次CNO来诱发3次急性胰腺炎。在首次急性胰腺炎发作后28天来评估胰腺损伤情况。3、通过天狼星红染色（Sirius red）、Ki-67染色以及巨噬细胞标志物（F4-80）染色观察对比雨蛙素或M3受体激活的小鼠中CP的典型特征。（五）药物性拮抗M3受体干预雨蛙素诱导的急性胰腺炎1、观察预处理特异性M3受体抑制剂氢溴酸达非那新对雨蛙素诱导的野生型（WT）小鼠与胰蛋白酶过表达（Try/BAC）小鼠AP模型胰腺损伤及炎症的影响。结果:（一）人体胰腺腺泡细胞表达M3受体,但不表达CCKA受体1、在健康供体分离出胰腺腺泡细胞中获取总RNA,通过RNA测序发现CCKA受体表达量几乎不表达,结果中可观察到M3受体显著表达。利用RT-PCR检测验证RNA测序结果,人来源的胰腺细胞中只存在M3受体。2、不同剂量的CCK-8对人胰腺腺泡细胞都毫无反应,淀粉酶维持低浓度状态。卡巴胆碱随着浓度增加可观察到明显的增加趋势,在10-6M浓度时达到峰值,上清中释放的淀粉酶高达12倍左右。从形态学上观察到卡巴胆碱刺激可引起人腺泡细胞呈花环样改变。（二）小鼠体内M3受体激活诱导急性胰腺炎发生1、构建胰腺腺泡细胞特异性表达突变的M3受体的小鼠（h M3/BAC）,蛋白水平可观察到h M3/BAC小鼠明显表达人源的M3受体,证明小鼠胰腺腺泡细胞中存在基因的重组并且表达人源的突变M3受体。2、在对照组BAC小鼠胰腺腺泡细胞中,CCK和卡巴胆碱通过EB染色观察到腺泡细胞损伤和淀粉酶分泌,而对CNO无应答。h M3/BAC小鼠的胰腺腺泡细胞对CCK、卡巴胆碱和CNO都可产生类似的腺泡损伤。这表明通过CNO和卡巴胆碱刺激M受体的激活可导致胰腺腺泡细胞损伤。3、通过探索不同剂量与次数CNO给药来刺激小鼠体内M3受体诱导AP的发生,结果发现用单次6mg/kg剂量CNO刺激h M3/BAC小鼠可构建AP模型。4、与对照组和h M4受体小鼠相比,在CNO处理的h M3受体小鼠中,胰腺水肿程度和血清淀粉酶水平升高。病理上也可观察到h M3/BAC小鼠胰腺出现明显的水肿、炎症细胞侵润以及胰腺腺泡细胞坏死。5、在CNO激活h M3/BAC小鼠中胰腺M3受体后,观察早期3h与24h后胰腺组织中p62蛋白增加以及LC3I向LC3II转变增多。在激活小鼠胰腺h M3受体诱导的AP模型中可观察到自噬受损的特征。6、利用Pdx1启动子介导Cre酶的表达,与h M3/BAC小鼠相似,CNO诱导h M3/Pdx1小鼠也可以引起明显的胰腺水肿、血清淀粉酶释放以及胰腺损伤包括炎症细胞的侵润。7、与雨蛙素诱导的AP比较,CNO刺激h M3/BAC和h M3/Pdx1小鼠M3受体可引起更严重胰腺组织水肿、更高的血清淀粉酶、胰腺组织病理更严重以及细胞凋亡与坏死更明显。（三）刺激小鼠M3受体引起NF-κB通路的激活以及降低IKKβ调节NF-κB通路改善AP的预后。1、与对照组相比,通过CNO激活h M3/BAC小鼠胰腺M3受体观察到IκBα的表达显著降低与增加p-P65（Ser 536）的表达。通过免疫组化蛋白定位分析,h M3/BAC小鼠胰腺组织中可观察到大量的P65蛋白细胞核着色。提示胰腺M3受体的激活可诱发NF-κB通路的活化。2、相比对照组以及雨蛙素诱导的AP组,CNO刺激h M3/BAC小鼠胰腺组织中MCP1、TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA水平明显增加,提示炎症水平更高。3、通过特异性敲除胰腺腺泡细胞上NF-κB通路上游关键蛋白IKKβ,观察到小鼠胰腺组织中IKKβ水平显著下降。雨蛙素诱导AP模型中胰腺IKKβ敲除显著降低血清淀粉酶水平、胰腺病理损伤、炎症细胞募集以及细胞凋亡。同样对比CNO处理的h M3/BAC组,纯合子IKKβf/f/h M3/BAC小鼠CNO刺激后胰腺损伤、炎症以及细胞凋亡显著降低。因此敲除胰腺IKKβ表达可缓解M3受体诱导的胰腺炎。4、在雨蛙素以及CNO诱导h M3/BAC小鼠AP模型中,选择性IKKβ抑制剂TPCA-1的处理减轻了胰腺病理损伤以及炎症细胞侵润。（四）反复刺激小鼠体内M3受体可发展为慢性胰腺炎1、在急性胰腺炎早期尤其是在CNO刺激h M3/BAC小鼠中可观察到TGF-β与α-SMA的m RNA水平明显上调,提示可能向慢性炎症过程进展。通过观察AP诱导后一周内胰腺病变的进展与恢复情况,h M3/BAC小鼠在单次注射CNO后一周时大致恢复,但也可观察到少许慢性炎症侵润。相比之下,单次CNO诱导h M3/Pdx1小鼠的急性胰腺炎后,胰腺重量明显变小。结果提示激活M3受体可造成急性胰腺炎恢复延迟。2、三天雨蛙素处理的小鼠胰腺4周后恢复正常,而大部分h M3/BAC小鼠以及全部的h M3/Pdx1小鼠的胰腺病理组织出现慢性炎症、纤维化、脂肪组织侵润、胰腺萎缩等典型CP的特征,甚至h M3/Pdx1小鼠可见腺管上皮化生（ADM）。因此反复刺激小鼠胰腺M3受体可发展慢性胰腺炎。3、对比雨蛙素刺激,h M3/BAC与h M3/Pdx1小鼠诱导CP后胶原纤维增生明显、胰腺细胞增殖能力明显增加以及更弥漫的炎症细胞侵润,尤其是h M3/Pdx1小鼠更显著。（五）M3受体拮抗剂缓解雨蛙素诱导的胰腺炎1、在雨蛙素诱导的野生型小鼠与Try/BAC小鼠AP模型中,预处理选择性的M3受体拮抗剂氢溴酸达非那新可显著改善胰腺损伤。结论:1、证实在人体内胰腺腺泡细胞中M3受体的表达与功能,而不存在CCKA受体。2、通过分离的突变M3受体转基因小鼠胰腺腺泡细胞,CNO刺激突变M3受体可导致细胞损伤。激活小鼠（h M3/BAC和h M3/Pdx1）体内突变M3受体诱导AP发生,建立了一种相比雨蛙素模型更严重、具有临床相关性的AP模型。3、由M3受体诱导AP模型中可观察到NF-κB信号通路的激活以及炎症增加。通过在小鼠中NF-κB上游IKKβ的敲除可减轻激活M3受体诱导的胰腺炎,同时观察到特异性IKKβ拮抗剂TPCA-1也可以缓解胰腺炎。4、M3受体诱导的胰腺炎恢复延迟,通过反复刺激小鼠（h M3/BAC和h M3/Pdx1）体内M3受体可发展为慢性胰腺炎。5、M3受体特异性拮抗剂氢溴酸达非那新可缓解雨蛙素诱导的AP损伤。以M3受体为靶点可能为人类胰腺炎的预防和治疗策略提供一种新的途径。