论文部分内容阅读
研究背景:众所周知活性氧簇（ROS）在心血管病理和生理过程中发挥重要作用,但低剪切力（LSS）诱导ROS的具体机制尚不明确。持续证据表明血管紧张素Ⅱ型一受体（AT1R）跟血管炎症、凋亡和氧化应激密切相关。研究目的:探讨血管紧张素Ⅱ型一受体（AT1R）在LSS诱导的活性氧簇中的作用,并阐明其调控eNOS磷酸化和NO合成的机制。研究方法:我们选用人脐静脉内皮细胞株EA.hy926（HUVECs）,将其作用于平行板流动腔,分别施加0、5、15、30、60和120分钟低剪切力（3dyn/cm2）。Western Blotting检测AT1R（血管紧张素Ⅱ型一受体）、AT2R（血管紧张素Ⅱ型二受体）、AKT、ERK、eNOS蛋白和对应的磷酸化水平,PCR测量AT1R mRNA水平,化学发光法DAF、DCFH和DHE检测细胞内ROS及NO含量,细胞免疫荧光检测AT1R表达,流失细胞仪检测细胞内ROS及NO含量。为了进一步明确整体动物实验中不同剪切力区域AT1R和ROS的表达,取六只C57BL/6小鼠主动脉弓部和主动脉降部,检测AT1R和ROS表达情况。应用小干扰RNA和药物抑制剂Losartan（1μM）抑制内皮细胞AT1R,LSS作用30分钟前后,检测AT1R、AKT、ERK和eNOS蛋白及磷酸化水平。AKT抑制剂LY29002（20μM）和ERK抑制剂PD98059（50μM）作用内皮细胞30分钟后检测AKT、ERK和eNOS蛋白及磷酸化水平。结果:LSS显著激活内皮ROS和AT1R。运用Losartan促进eNOS Ser1177,633磷酸化水平,抑制了eNOS Thr495磷酸化,促进内皮NO产生。同时,Losartan也明显抑制了内皮ROS水平。沉默AT1R可通过促进AKT和ERK磷酸化活性来阻止LSS诱导的eNOS-Ser1177、Ser633去磷酸化,Thr495磷酸化。运用AKT抑制剂和ERK抑制剂,明显抑制Losartan诱导的内皮细胞eNOS-Ser1177,Ser633磷酸化和Thr495去磷酸化。NO外源性和内源性供体L-arginine和SNP能够明显抑制低剪切力诱导的ROS产生。eNOS非特异性抑制剂L-NAME明显激活了ROS。结论:LSS通过激活AT1R降低eNOS磷酸化和NO水平导致内皮ROS产生。研究背景:动脉粥样硬化（AS）是一种累计大中动脉的长期慢性炎症反应疾病,病理机制是内皮炎症反应及局部平滑肌增生增生,引起管腔狭窄,造成远端动脉缺血,引起心血管事件。低剪切力诱导的内皮细胞炎症反应是动脉粥样硬化发生发展的病理基础,但低剪切力如何诱导内皮细胞炎症反应至今不是很明确。血管紧张素Ⅱ型一受体（AT1R）是肾素血管紧张素醛固酮系统中重要组成成分,参与动脉粥样硬化的进展。研究目的:探讨AT1R在LSS诱导的内皮细胞炎症中的作用,并探讨其下游信号通路。研究方法:我们选用人脐静脉内皮细胞株EA.hy926（HUVECs）,将其作用于平行板流动腔,分别施加0、5、15、30、60和120分钟的低剪切力（≈3dyn/cm2）。Western Blotting检测血管紧张素Ⅱ型一受体（AT1R）、细胞间粘附分子（ICAM1）、血管细胞粘附分子（VCAM1）、NFκB、ERK、JNK、P38和对应的磷酸化水平,PCR测量AT1R、ICAM1、VCAM1 mRNA水平,细胞免疫荧光检测AT1R表达,。为了进一步明确整体动物实验中不同剪切力区域AT1R和炎症标记物（ICAM1、VCAM1）的表达,取六只C57BL/6小鼠主动脉弓部和主动脉降部,检测AT1R和ICAM1、VCAM1表达情况。应用小干扰RNA和药物拮抗剂Losartan（1μM）抑制内皮细胞AT1R,LSS作用30分钟前后,检测AT1R、ICAM1、VCAM1、ERK、JNK、P38蛋白总量及磷酸化水平。小干扰RNA和ERK抑制剂PD98059（50μM）作用内皮细胞30分钟后检测ICAM1、VCAM1、ERK、JNK、P38蛋白及磷酸化水平。提取细胞核蛋白,检测在不同条件下NFκB入核表达。我们还通过Tunel染色和流失细胞仪检测AT1R拮抗剂对内皮细胞凋亡的影响。结果:LSS显著激活内皮细胞炎症分子ICAM1、VCAM1、AT1R、NFκB。Losartan和AT1R siRNA显著抑制了内皮细胞ICAM1、VCAM1、p-ERK、p-NFκB表达以及NFκB核转位,同时,ERK抑制剂和ERK siRNA也明显抑制了显著抑制了内皮细胞ICAM1、VCAM1、p-ERK、p-NFκB表达和NFκB核转位。除此之外,Losartan也显著减少了内皮细胞的凋亡。结论:低剪切力通过AT1R/ERK信号通路诱导内皮细胞炎症,Losartan能对抗LSS诱导的内皮细胞炎症和凋亡。