免疫缺陷病毒HIV／SIV胞膜蛋白Env gp120／gp41的受体或抗体分子与毒素蛋白相融合而形成的靶向性毒素，能够选择性杀伤被HIV／SIV感染后于表面表达Env gp120的细胞。但是，毒素蛋白作为异源分子，具有很强的免疫原性。CD4和绿脓杆菌毒素PE40的融合蛋白在临床试验中产生了剂量限制性的肝细胞毒性，并引起抗体的产生，从而在再次使用时会被抗体中和而失效。为避免毒素的免疫原性而对毒素进行的各种修饰均未达到理想的效果。本研究采用一种新的技术路线，利用CD4分子胞外V1V2区、化学趋化因子受体CXCR4和CCR5作为结合HIV／S1Vgp120的靶向性分子，将其与人的组蛋白H1相融合，通过H1与DNA的结合作用，在CD4、CXCR4和CCR5的引导下将毒素基因表达型质粒靶向性导入被HIV／SIV感染的细胞，以期通过毒素基因在靶细胞内部的表达并合成出毒素蛋白而发挥杀伤被HIV／SIV感染的细胞的目的。该方法在理论上能够完全避免毒素的免疫原性，减小毒素对正常细胞的毒副作用。本实验利用PCR技术以携带PE40（PEⅡ和Ⅲ结构域）基因的质粒为模板扩增出PE结构域Ⅲ（PE domainⅢ）的编码序列，同时将PEⅢC端的REDLK残基突变为KDEL，得到强效突变毒素PEⅢ_mut的基因片段。将该突变基因插入真核细胞表达载体pcDNA3.1（-）mychisA中，构建了毒素基因的真核表达重组质粒pA-PEⅢ_mut。为了更好地将毒素基因限制在HIV感染的细胞中表达，另将毒素基因置于HIV 5′LTR下游构建了真核细胞表达质粒pYL-PEⅢ_mut，以使毒素基因的表达受HIV TAR／Tat的调控，当细胞内有病毒Tat蛋白存在时毒素基因才能表达。该带有毒素基因的表达型重组质粒即使被误导入正常细胞，因该细胞未受HIV的感染而无Tat蛋白的存在，毒素基因不能表达，细胞将不会被杀伤。利用RT-PCR方法，从正常中国人外周血淋巴细胞cDNA中获得CD4V1V2、CXCR4和CCR5的完整编码序列，进一步通过PCR扩增分别去掉CXCR4和CCR5羧基端胞内区的34和52个氨基酸，同时在C端引入长为9个氨基酸残基的流感病毒血凝素HA标签以便于蛋白检测。利用PCR技术从正常中国人外周血淋巴细胞基因组DNA中获得组蛋白H1C端86个氨基酸的编码序列，该序列中含有35个赖氨酸。利用P．pastoris酵母表达载体pPIC9、pHIL-S1及pPIC9K构建了表达靶向蛋白CD4V1V2、CD4V1V2-H1₈₆、CXCR4、CXCR4-H1₈₆、CCR5及CCR5-H1₈₆的一系列表达型重组质粒。各表达质粒线性化后通过电转或原生质体法分别转化入酵母株GS115、KM71和SMD1168中。经小规模诱导培养，从pPIC9重组体的KM71转化株中筛选出高表达CD4V1V2、CD4V1V2-H186的菌株。CD4V1V2和CD4V1V2-H186的表达量分别达1.4g／L和428mg／L，其中CD4V1V2在培养上清总蛋白中的含量大于90％，而CD4V1V2-H1₈₆在培养上清总蛋白中的含量为7.5％左右。由SMD1168表达的CD4V1V2-H1₈₆约为370mg／L，占培养上清的6％。从pPIC9和pHIL-S1重组质粒的KM71和GS115酵母转化子中未筛选出高表达CXCR4和CCR5各相关融合蛋白的酵母菌株。进一步利用G418的生长抑制作用，对生长于含1.25mg／ml和1.75mg／ml G418的培养基上的KM71／pPIC9K-C4H和KM71／pPIC9K-C5H转化子进行筛选，得到CXCR4-H1₈₆和CCR5-H1₈₆的高表达株。分泌至上清的CXCR4-H1₈₆-HA和CCR5-H1₈₆-HA分别占培养上清总蛋白的29％和15.5％左右，相应含量为454mg／L和167mg／L。选择CD4V1V2-H1₈₆和CCR5-H1₈₆-HA的高表达菌株进行摇瓶大规模培养诱导，从SDS-PAGE凝胶中回收目的蛋白，所得靶向蛋白CD4V1V2-H1₈₆和CCR5-H1₈₆-HA的纯度较高。进一步通过酸性丙酮的沉淀除去蛋白质中的SDS。利用CD4V1V2-H1₈₆和CCR5-H1₈₆-HA作为靶向蛋白，pA-PEⅢ_mut作为毒素基因表达型重组质粒进行细胞试验。根据蛋白质与DNA的电荷摩尔数比为1：0.9制备转染用复合物，同时按1μl／1μgDNA的量加入脂质体Lipofectin。分别以1μg、2μg和3μg质粒DNA的剂量转染被SIV感染的人T细胞系Hut-78细胞，同时用未受感染的Hut-78正常细胞作为对照。结果显示，靶向蛋白及单独使用的毒素基因表达质粒本身对正常细胞及被SIV感染的细胞均无毒副作用，靶向蛋白能介导毒素基因选择性进入被SIV感染的细胞。细胞试验所得的数据表明，CD4V1V2-H1₈₆介导的毒素基因在3μg的DAN剂量条件下发挥作用，对被SIV感染的Hut-78（Hut-78／SIV）细胞的杀伤率约为37％；而CCR5-H1₈₆-HA和CD4V1V2-H1₈₆与CCR5-H1₈₆-HA共同介导的毒素基因在1μg的质粒DNA剂量条件下即发挥细胞毒作用。CCR5-H1₈₆-HA单独介导时，在1μg、2μg和3μg质粒DNA的剂量条件下，被杀伤的Hut-78／SIV细胞介于50～60％之间；CCR5-H1₈₆-HA与CD4V1V2-H₈₆共同介导时，在1μg、2μg和3μg的质粒DNA剂量条件下，被杀伤的Hut-78／SIV细胞分别约为66％、62％和94％。细胞试验表明，本研究所设计的靶向蛋白能有效地介导毒素基因表达质粒靶向性转入被SIV感染的细胞中，所构建的毒素基因表达质粒pA-PEⅢ_mut能表达毒素蛋白PEⅢ_mut。该毒素突变型能强烈杀伤靶细胞。由此推测，利用靶向蛋白CXCR4-H1₈₆-HA和HIV LTR调控的毒素基因表达质粒pYL-PEⅢ，同样能有效地选择性杀伤被HIV感染的细胞。本研究为毒素药物的应用提供了一个新的途径。该技术路线不仅适用于艾滋病的治疗，还可通过靶向蛋白的更换，用于癌症或其它病毒感染疾病或自身免疫疾病等的治疗，由此开辟一条对上述诸疾病可能有良好治疗效果的新途径。