南方大口鲇和中华倒刺鲃抗菌相关蛋白的研究

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随着水产养殖业的繁荣,水环境污染加剧,鱼类养殖频频发生各种疾病(细菌、病毒、寄生虫),制约了渔业的发展,防治过程中大量地使用的抗生素和化学药物,对鱼类品质又带来负面影响,而且严重危害消费者的健康。为了提高渔业的生产能力,生产健康绿色鱼类食品,研究开发鱼类天然的新型的抗病药物显得十分必要。生物抗菌蛋白是一类具有抗菌活性的蛋白质,广泛存在于生物界,在机体抵抗病原菌的入侵方面起着重要的作用,被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。大口鲇和中华倒刺鲃生长快产量高,肉质细嫩,味道鲜美,消费市场广阔,因此研究清楚大口鲇和中华倒刺鲃的抗菌蛋白和抗病机制可以给渔业带来巨大的市场利益。从成都通威水产科技有限公司取几条南方大口鲇(Silurus meridionalis)和中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)。为更广泛地研究抗菌相关蛋白,先采用三种抽提体系分别研究了健康大口鲇和患病大口鲇的皮肤分泌液和各个组织抽提样品里抗菌因子的抗菌活性及其理化性质,再研究了大口鲇和中华倒刺鲃的血清凝集素。用抽提体系Ⅰ“0.1%TritonX-100+0.2%NaAc+1mmol/L PMSF”和抽提体系Ⅱ“0.1%TFA+50%乙醇+1mmol/L PMSF”研究了健康南方大口鲇皮肤分泌液、皮肤、胃、肠、肝脏和肾的抗菌因子,结果发现用抽提体系Ⅱ抽提得到的皮肤分泌液样品的抗菌活性最强。它对具有广谱的抗菌活性,对G+细菌(枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌A309、粪链球菌)和G细菌(大肠杆菌、绿脓杆菌)都有较强的抗菌活性;经胃蛋白酶在37℃下作用30min后,该抗菌因子的抗菌活性丢失;该抗菌蛋白在pH6.0和7.0时抗菌活性稳定,pH5.0或8.0时抗菌活性减弱了一些;将其煮沸10min后离心,上清的抗菌活性依然很稳定;采用20%~50%硫酸铵饱和度梯度对该抗菌因子进行了一定程度的纯化。采用抽提体系Ⅲ“10 mmol/L HEPES+112 mmol/L NaCl+3.4 mmol/L KCl+2.4mmol/L NaHCO3,pH 7.4”初步研究了一条患病大口鲇的的皮肤、肾、肝中抗菌因子的抗菌活性和蛋白质组成。因为凝集素是鱼类主要的抗菌相关因子,所以着重研究了健康大口鲇和中华倒刺鲃血清中的天然凝集素。为进一步的基因研究奠定了基础从大口鲇血清分离到一种天然的凝集素分子,能够凝集多种不同的抗原物质。该天然凝集素不能透过半透膜,是一种大分子物质;经过蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶作用过后,丧失凝集活性,是一种蛋白质;用DNase、RNase和脂溶剂乙醚处理过后,其凝集活性保持不变,说明其组成与核酸和脂类物质无关。该凝集素耐热性好,75℃条件下保温1h活性保持不变;而且对SDS不敏感。在一定的温度范围内(4℃~37℃),随着温度的升高该凝集素凝集能力增强。经糖的专一性抑制实验显示,蔗糖和半乳糖对凝集反应有抑制作用,说明这2种糖分子是凝集素在识别和凝集过程中起一定作用的糖分子。从中华倒刺鲃血清分离到一种天然的凝集素,能够凝集多种不同的抗原物质。该天然凝集素不能透过半透膜,是一种大分子物质:经过蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶作用过后,丧失凝集活性,是一种蛋白质:用DNase、RNase和脂溶剂乙醚处理过后,其凝集活性保持不变,说明其组成与核酸和脂类物质无关。该凝集素耐热性好,60℃条件下保温1h活性保持不变;而且对SDS不敏感。在一定的温度范围内(4℃~37℃),随着温度的升高该凝集素凝集能力增强。经糖的专一性抑制实验显示,蔗糖和乳糖对凝集反应有抑制作用,说明这2种糖分子是凝集素在识别和凝集过程中起一定作用的糖分子。
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