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目的:明确缺氧是否通过HIF1 α促使肝癌细胞CCL28升高,以及CCL28是否影响肝癌细胞生物学特性及具有招募调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的功能,为探讨缺氧在肿瘤进程中可能具有的重要作用提供更多理论支持。方法:1.对多种人肝癌细胞系,缺氧(1%O2,5%CO2)和常氧(21%02,5%CO2)培养0、8、24、48小时后收集细胞和上清,Q-PCR和ELISA法分别检测CCL28的mRNA和上清蛋白的表达量。2.收集Ⅲ～Ⅳ期肝癌患者癌组织标本进行石蜡切片,免疫组化法检测CCL28及缺氧标志蛋白CAⅨ(碳酸酐酶Ⅸ)的表达并进行相关分析。3.通过慢病毒介导敲低人肝癌SK-HEP-1细胞HIF1 α的水平,Q-PCR和ELISA法检测HIF1 α基因沉默对缺氧时CCL28表达的影响。4.通过慢病毒介导过表达人肝癌SK-HEP-1细胞CCL28的水平,分析过表达CCL28基因对细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及粘附等细胞生物学行为的影响。5.制备稳定表达CCL28和虫荧光素酶基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞及对照细胞,C57BL小鼠建立活体成像用皮下移植瘤模型。小鼠成像和取材检测肿瘤生长情况。6.分离上一步取材小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞,Q-PCR测定Treg细胞特异性标记分子Foxp3的表达,从而间接反映肝癌局部Treg细胞的数量水平。。7.分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)加入趋化实验用的Transwell上室,下室加入缺氧/常氧条件培养基或重组CCL28/同型对照抗体,联合CCL28或CCR10(CCL28受体)的中和抗体进行阻断,流式分析趋化至下室的CD4+CD25+Foxp3+/CD4+细胞比例。明确缺氧是否通过CCL28招募PBMC中的Treg细胞及Treg细胞类型是否为CCR10阳性。8.免疫磁珠试剂盒分离获得人高纯CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,加入趋化实验用的Transwell上室,下室加入缺氧/常氧条件培养基或重组CCL28/同型对照抗体,联合CCL28或CCR10中和抗体进行阻断,通过流式细胞仪对趋化至下室的Treg细胞进行直接计数。明确缺氧是否通过CCL28直接招募Treg细胞及Treg细胞类型是否为CCR10阳性。结果:1.与常氧相比,缺氧可促使多种肝癌细胞系(SK-Hep-1、HepG2、Hep-3B)CCL28的mRNA和上清蛋白水呈缺氧时长依赖性增长。2.人肝癌临床标本的免疫组化检测显示CCL28与缺氧标志蛋白CAⅨ的表达呈正相关。3.利用慢病毒介导的RNA干扰技术敲低人肝癌细胞的HIF1 a表达水平,缺氧条件下CCL28的mRNA和蛋白水平相应降低,与空载体对照组相比P<0.05。4.人肝癌SK-HEP-1细胞CCL28过表达促进了细胞的增殖、迁移及粘附能力,但不影响细胞凋亡及侵袭。5.成功制备稳定表达CCL28和虫荧光素酶基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞及对照细胞,建立了活体成像用C57BL小鼠皮下移植瘤模型。活体成像系统和最后取材测量均显示CCL28高表达组瘤体明显大于空载对照组,P<0.05。6.分离上一步实验的小鼠肿瘤浸润淋巴细胞,Q-PCR测定表明肿瘤浸润性淋巴细胞Treg标志基因Foxp3的mRNA水平明显高于空载体对照组。7.Tranwell小室趋化实验中,上室加入人PBMC细胞,下室中人肝癌SK-Hep-1细胞的缺氧条件培养基与常氧条件培养基相比,重组CCL28因子培养基与对照培养基相比,趋化到下室的CD4+CD25+Foxp3+/CD4+细胞比例明显升高。并且这种升高可被CCL28或CCR10的中和抗体所阻断。8.Tranwell小室趋化实验中,上室加入高纯人Treg细胞,下室中人肝癌SK-Hep-1细胞的缺氧条件培养基与常氧条件培养基相比,重组CCL28因子培养基与对照培养基相比,趋化到下室的Treg细胞数明显升高。并且这种升高可被CCL28或CCR10的中和抗体所阻断。结论:缺氧通过HIF1α介导了肝癌细胞CCL28升高;CCL28具备多种生物学功能,一方面可促进肝癌细胞的增殖、迁移和粘附能力;另一方面可通过与Treg细胞表面的CCL28受体CCR10发生相互作用而趋化Treg细胞。缺氧所致CCL28升高在肝癌进程中可能具有重要作用。