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肺癌是威胁人类健康的最常见恶性肿瘤,尽管不断有新的化疗药物和放疗手段出现,但肺癌总的5年生存率仍不足15%。肺癌细胞体外培养的实验表明,在1000～5000个细胞中仅有1个细胞能在软琼脂上形成克隆,提示不是每个肺癌细胞都具有驱动肺癌形成的能力。近年来的研究表明,肿瘤是一种干细胞疾病,在肿瘤组织中存在少量癌干细胞。现已经从多种肿瘤组织中成功分离出癌干细胞,包括白血病、黑色素瘤、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和肠癌等。这些细胞具有无限的增殖能力、自我更新能力和分化能力,是肿瘤发生的根源。因此,探索癌干细胞的调控机制和寻找癌干细胞特异性分子,将为肿瘤的诊断和治疗提供有效的靶点。在调控干细胞自我更新、分化和增殖的研究中,一类调控性非编码微小RNA(microRNA,miRNA)的作用倍受人们关注。miRNA具有进化保守性、表达时空阶段性等特征,这些特征决定了它可能成为癌干细胞的特异性靶标。虽然肺癌干细胞是否存在特异性的miRNA目前尚未见文献报道,但与肺腺癌有关的miRNA中,let-7家族备受关注。let-7最早在线虫中发现,它调控细胞的分化和增殖的时序。let-7在肺癌组织中是低表达的,它能在转录后水平抑制RAS和HMGA2蛋白的表达,因此被认为是抑癌的“miRNA”。最近的文献显示let-7与癌干细胞关系密切,let-7通过改变乳腺癌干细胞自我更新和分化能力而抑制乳腺癌的发生。因此,深入阐明let-7在肺癌干细胞的功能,有望揭示let-7抑制肺癌的本质,并提供有效治疗肺癌的新方法。目的:检测从LLC细胞中分选的Sca-1+LLC细胞是否具有癌干细胞特性,并研究let-7在Sca-1+LLC细胞中的功能。方法:1. Sca-1+LLC细胞分离、培养和鉴定:免疫荧光检测Sca-1在LLC细胞的表达,以Sca-1作为磁珠分选的表面标志,从LLC细胞中分选Sca-1+LLC细胞和Sca-1-LLC细胞,流式细胞仪检测分选后细胞的纯度。为了鉴定Sca-1+LLC细胞是否具有癌干细胞特性,将分选的Sca-1+LLC细胞和Sca-1-LLC细胞分别培养于含有10% FBS的RPMI-1640培养基和含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)的无血清培养基。体外培养检测Sca-1+LLC细胞自我更新能力、分化能力以及对化疗药物的耐药能力,体内成瘤实验比较Sca-1+LLC细胞与Sca-1-LLC细胞致瘤能力的差异。2.检测let-7家族成员的表达:Trizol法分别从Sca-1+LLC细胞和Sca-1-LLC细胞中提取总RNA,使用TaqMan MicroRNA检测试剂盒检测let-7家族成员成熟体的表达,包括let-7a、let-7c、let-7d、let-7f和let-7g,通过与内参snoRNA202比较,计算检测基因的相对含量。3. let-7a慢病毒过表达载体构建、包装和滴度测定:通过PCR技术扩增pre-let-7a cDNA ,将扩增的片段插入载体pGCSIL-GFP中,形成重组的慢病毒载体pGCSIL-let-7a。pGCSIL-let-7a与辅助质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染入包装细胞293T细胞中,48小时后收集并浓缩病毒上清液。将病毒液进行系列稀释后感染293T细胞,通过实时定量PCR技术,检测各组293T细胞GFP含量来测定病毒的滴度。4. Lenti-let-7/Sca-1+LLC细胞分离、培养和鉴定:在感染复数为2、20和200时,将let-7a慢病毒颗粒和空载体病毒颗粒分别感染LLC细胞,通过在荧光显微镜下计数阳性细胞来测定各组的感染效率。利用磁珠分选技术将Sca-1+LLC细胞从感染的LLC细胞中分选出来,并分别命名为Lenti-let-7/Sca-1+LLC细胞和Lentivector/Sca-1+LLC细胞。体外培养检测两者在自我更新、增殖和耐药能力的差异,体内成瘤实验比较两者致瘤性的差异。5. let-7联合紫杉醇对lewis肺癌的治疗效应:在lewis肺癌体积达到100～200mm3时,将荷瘤小鼠分成五组。前三组分别单独给予let-7a慢病毒颗粒(1×108 TU/只)、空载体病毒颗粒(1×108 TU/只)和生理盐水(100μl)瘤内注射;第四组给予腹腔注射紫杉醇(l0 mg/kg,连续使用10d);第五组给予let-7a慢病毒颗粒(1×108 TU/只)和紫杉醇(l0 mg/kg,连续使用10d)联合治疗。在注射后连续测量各组肿瘤的体积,并在瘤内注射18 d后处死小鼠,计数各组肺转移节结数、瘤重和抑瘤率,免疫组化检测各组肿瘤K-ras蛋白的表达。结果:1.在荧光显微镜下可以见到少量LLC细胞Sca-1染色阳性,流式细胞仪检测Sca-1阳性细胞百分比为(10.23±1.65)%。磁珠分选后Sca-1阳性细胞百分比为(93.92±1.07)%。在体外无血清培养体系中,Sca-1+LLC细胞可以生长为非贴壁的、多细胞的细胞球,细胞球形成率为10%。而Sca-1-LLC细胞肿瘤细胞球形成率为1%。在含有血清的培养基中,Sca-1+LLC细胞可以分化为Sca-1-LLC细胞,而Sca-1-LLC细胞不能分化为Sca-1+LLC细胞。Sca-1+LLC细胞对于化疗药物具有更强的耐药性,这与它高表达ABCG2 mRNA有关。体内的成瘤实验表明,Sca-1+LLC细胞的致瘤能力是Sca-1-LLC细胞的25倍以上。2.实时定量PCR检测显示,let-7a、let-7d和let-7g在Sca-1+LLC细胞的表达水平有明显的下降。与Sca-1-LLC细胞相比,分别下降了1.32倍、1.27倍和1.45倍。而let-7c和let-7f的表达水平在两者之间没有显著性的差别。3.重组的慢病毒载体pGCSIL-let-7a通过PCR扩增、酶切以及测序,证明目的片段(MI0000557)成功克隆到慢病毒载体中。将pGCSIL-let-7a与辅助质粒共转染293T细胞,48h后收集并浓缩的病毒颗粒滴度可达到2×109TU/ml。4.在复感染指数(MOI)为20时,病毒感染LLC细胞的效率约为70%。病毒感染后,LLC细胞系中Sca-1阳性细胞的比例下降至5.47%。Lenti-let-7/Sca-1+LLC细胞肿瘤细胞球形成率为(0.01±0.005)%,Lentivector/Sca-1+LLC细胞肿瘤细胞球形成率为(0.09±0.015)%,两者有显著性差异(P<0.01)。而且培养7 d后,Lenti-let-7/Sca-1+LLC细胞形成的肿瘤细胞球体积较Lentivector/Sca-1+LLC细胞小。Lenti-let-7/Sca-1+LLC细胞的耐药能力较Lentivector/Sca-1+LLC细胞下降,在各化疗药物中两者均有显著性差异(P<0.01)。体内成瘤实验,lentivector/Sca-1+LLC细胞形成肿瘤所需的细胞为2×104个,而lenti-let-7/Sca-1+LLC细胞需要5×105以上的细胞。5.生理盐水组和Lentivector组肿瘤生长速度最快,两者之间无显著性差异(P >0.05)。let-7a或紫杉醇单独治疗,肿瘤生长均出现明显抑制,在28 d抑瘤率分别为49.6%和70.1%,较生理盐水组均有显著性差异(P <0.01)。Lenti-let-7a联合紫杉醇治疗的抑瘤率为92.9%,较生理盐水组和let-7a组均有显著性差异(P <0.01),其中有一只小鼠(33%)在治疗12d后肿瘤消失。let-7病毒颗粒抑制肿瘤的效应与K-Ras蛋白的下降相关。结论1.在LLC细胞系中,Sca-1是癌干细胞的表面标志之一,Sca-1+LLC细胞具有癌干细胞的特性。2.在Sca-1+LLC细胞中let-7是低表达,let-7的低表达是维持Sca-1+LLC细胞干细胞特性的重要条件。3. let-7a慢病毒载体是肺癌基因治疗的一个新的途径,联合let-7和化疗药物有望成为治愈肺癌的有效手段。