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研究背景与目的神经母细胞瘤是小儿最常见的恶性实体肿瘤,来源于胚胎神经嵴的交感神经元,已知神经嵴的交感神经元可发育为肾上腺髓质,而肾上腺在胚胎发育过程中的异常与神经母细胞瘤的发生密切相关。Wnt1信号转导通路能控制神经前体细胞的增殖与分化平衡,对于神经母细胞瘤的起源细胞——胚胎神经嵴中交感神经元细胞的诱导发生是否是至关重要的因素,目前尚不明确。本实验目的为应用免疫组化方法检测新生儿尸解肾上腺、＞2岁小儿尸解肾上腺和神经母细胞瘤组织中经典Writ信号通路中Wnt1、β-catenin和CyclinD1的表达,并通过Real-time PCR方法检测神经母细胞瘤及瘤旁肾上腺组织中wnt1、β-catenin和cyclinD1 mRNA的表达,从而探讨Wnt1信号通路在神经母细胞瘤发生发展过程中的作用机制。材料和方法主要材料复旦大学附属儿科医院尸解小儿肾上腺组织腊块,外科手术切除神经母细胞瘤组织腊块,手术切除新鲜肿瘤及瘤旁肾上腺,Wnt1抗体(北京奥维亚公司),β-catenin、Cyclin D1(Sant Cruz公司),RT—PCR试剂盒(德国Qiagen公司)。方法应用免疫组化方法检测新生儿肾上腺、＞2岁小儿肾上腺及各期神经母细胞瘤组织中Wnt1信号通路各成分Wnt1、β-catenin和CycinD1在蛋白水平的表达及细胞内定位情况。应用Real-timePCR的方法检测上述Wnt1信号通路各分子在神经母细胞瘤及瘤旁肾上腺组织中mRNA水平的表达结果一、Wnt信号通路蛋白水平的表达1.23例新生儿肾上腺、20例＞2岁小儿肾上腺及34例术前未接受化疗的神经母细胞瘤组织(24例术前接受过化疗)中Wnt1染色均为阳性,其中34例术前未接受过化疗的肿瘤组织Wnt1阳性染色IOD值明显高于新生儿肾上腺组织(P=0.002);新生儿肾上腺组织Wnt1阳性染色明显强于＞2岁小儿肾上腺组织(P=0.014);进展期(Ⅲ-Ⅳ期)肿瘤较Ⅰ-Ⅱ期肿瘤Wnt蛋白染色IOD值增高(P=0.02);Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中术前未接受化疗的Wnt1阳性染色明显高于术前接受化疗的肿瘤(P=0.014):Shimade分型组织结构不良型肿瘤(UH)较组织结构良好型肿瘤(FH)Wnt1阳性染色IOD值增高(P=0.038)。2.β-catenin在23例新生儿肾上腺、20例＞2岁小儿肾上腺及34例术前未接受化疗的神经母细胞瘤组织中染色均为阳性,其中34例术前未接受过化疗的肿瘤表达明显高于新生儿肾上腺(P=0.000),新生儿肾上腺β-catenin表达明显高于＞2岁小儿肾上腺(P=0.031);进展期(Ⅲ-Ⅳ期)肿瘤较Ⅰ-Ⅱ期肿瘤β-catenin蛋白染色IOD值增高(P=0.039);Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中术前未接受化疗的β-catenin阳性染色高于术前接受化疗的肿瘤(P=0.038);Shimade分型组织结构不良型肿瘤(UH)较组织结构良好型肿瘤(FH)β-catenin蛋白染色IOD值增高(P=0.035)。3.23例新生儿肾上腺及20例＞2岁小儿肾上腺组织中CyclinD1染色均为阴性,肿瘤组织中CyclinD1表达阳性,其中Ⅰ-Ⅱ期肿瘤与Ⅲ-Ⅳ期术前未接受化疗的肿瘤CyclinD1蛋白表达无差别(P=0.874);Ⅲ-Ⅳ期术前未接受化疗的肿瘤CyclinD1蛋白表达明显高于术前接受化疗的肿瘤(P=0.001);UH肿瘤表达高于FH肿瘤(P=0.029)。4.34例术前未化疗肿瘤组织中Wnt1及β-catenin蛋白表达具有明显的相关性(R=0.764,P＜0.01),Wnt1及CyclinD1蛋白表达具有明显的相关性(R=0.448,P＜0.01),并且β-catenin与CyclinD1蛋白表达也存在明显的相关性(R=0.513,P＜0.01)。二、Wnt信号通路mRNA的表达1.26例术前未接受过化疗的神经母细胞瘤组织中wnt1的mRNA表达高于瘤旁正常肾上腺组织(P=0.012);进展期(Ⅲ-Ⅳ期)术前未化疗肿瘤较Ⅰ-Ⅱ期肿瘤wnt1的mRNA表达高(P=0.026);Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中术前未接受化疗的wnt1mRNA表达与术前接受化疗的肿瘤相比明显升高(P=0.027);组织结构不良型肿瘤中wnt1的mRNA表达较组织结构良好型肿瘤高(P=0.012)。2.26例术前未接受过化疗的神经母细胞瘤组织及瘤旁肾上腺中β-cateninmRNA表达水平无明显差异(P=0.519);Ⅰ-Ⅱ期肿瘤与Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中β-cateninmRNA表达水平无统计学意义(P=0.667);Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中术前未接受化疗的β-catenin mRNA表达与术前接受化疗的肿瘤相比无明显差别(P=0.683);组织分型不同的肿瘤中β-catenin mRNA表达水平无统计学意义(P=0.261)。3.26例术前未接受过化疗的神经母细胞瘤组织中cyclinD1的mRNA含量明显高于瘤旁正常肾上腺组织(P=0.000);进展期(Ⅲ-Ⅳ期)术前未化疗肿瘤较术前Ⅰ-Ⅱ期肿瘤cyclinD1的mRNA表达无明显升高(P=0.097);Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中术前接受化疗的cyclinD1 mRNA表达与术前未接受化疗的肿瘤降低(P=0.033);组织结构不良型肿瘤中cyclinD1的mRNA表达较组织结构良好型肿瘤升高(P=0.017)。4.26例术前未化疗肿瘤组织中wnt1与β-catenin在mRNA水平表达无相关性(R=-0.101,P＞0.05),β-catenin与cyclinD1在mRNA水平表达也无相关性(R=0.244,P＞0.05),但是wnt1与cyclinD1在mRNA水平表达具有明显的相关性(R=0.488,P＜0.05)结论1、Wnt1信号通路中Wnt1、β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达在肾上腺发育成熟过程随年龄增长减少,表明其对肾上腺细胞分化成熟可能有一定的调控作用。2、Wnt1、β-catenin和Cyclin D1蛋白在神经母细胞瘤异常升高,且三种蛋白间的表达具有相关性,提示Wnt1通路异常可能是导致神经母细胞瘤的机制之一。3、Wnt1、β-catenin蛋白阳性染色IOD值与神经母细胞瘤分期、组织分型密切相关,表明过度激活的Wnt1信号通路可能参与对神经母细胞瘤分化和侵袭能力的调节。4、神经母细胞瘤组织中wnt1、cyclinD1在mRNA水平升高,进一步提示Wnt1信号通路在神经母细胞瘤中存在激活现象。5、神经母细胞瘤中Wnt1蛋白高表达并不直接激活β-catenin基因,β-catenin蛋白表达的升高可能只与基因转录成mRNA以后的调节异常有关。