【摘 要】
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日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus JEV）感染引起的人畜共患传染病。通过疫苗免疫接种,能够预防JE。前期研究发现,JEV优势基因型由基因III型转变为基因I型,而基因III型来源的疫苗不能够完全保护基因I型JEV感染,需要研发基因I型疫苗。为此,开展了如下研究。为了鉴定细胞传代致弱的基因I型弱毒株S
【基金项目】
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a grant（17391901600） from Shanghai Science and Technology Commission of China；
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日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）是由日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus JEV）感染引起的人畜共患传染病。通过疫苗免疫接种,能够预防JE。前期研究发现,JEV优势基因型由基因III型转变为基因I型,而基因III型来源的疫苗不能够完全保护基因I型JEV感染,需要研发基因I型疫苗。为此,开展了如下研究。为了鉴定细胞传代致弱的基因I型弱毒株SD12-F120,在体外和体内比较了SD12-F120株与亲本强毒株SD12的表型和基因型差异。SD12-F120在BHK-21细胞上形成了较小的病毒噬斑,且在小鼠原代神经元细胞和小鼠脑中的复制能力降低。通过腹腔或脑内途径接种高达105 PFU的SD12-F120,小鼠均未表现出JEV感染的临床症状,表明SD12-F120的神经侵袭力和神经毒力明显降低。SD12-F120免疫小鼠后,使用SD12攻毒,免疫小鼠未出现临床症状,获得全面保护。比较分析了SD12-F120和SD12间核苷酸序列差异,共发现29个核苷酸突变,其中20个属于无义突变,9个突变导致8个氨基酸变异,其中E蛋白上2个,NS1蛋白上1个,NS3蛋白上2个,NS4B蛋白上1个和NS5蛋白上2个。将SD12-F120和SD12间的氨基酸变异与其他四对弱毒株和强毒亲本株间的氨基酸变异进行比较,发现变异氨基酸的数量和位置彼此不尽相同。在比较的五组弱毒株和强毒亲本株中,E138和E176变异分别存在于四组和三组中,而其他的氨基酸突变几乎是各自所独有。这一结果表明,JEV致弱过程中的遗传变异具有毒株特异性,显示了JEV减毒/毒力相关机制的复杂性。由于SD12-F120是在BHK-21细胞上连续传代获得的,不符合疫苗生产要求。为此,SD12-F120在Vero细胞连续传代20代,获得了Vero细胞适应株SD12-F120VC。分析病毒滴度发现,随着在Vero细胞上传代次数的增加,病毒滴度逐渐增高。SD12-F120VC的病毒滴度显著高于SD12-F120,表明SD12-F120VC在Vero细胞上具有良好的适应性。噬斑分析发现,SD12-F120VC的噬斑形态与SD12-F120基本一致。用SD12-F120VC免疫小鼠,免疫小鼠能够抵抗基因I型SD12毒株的攻击,但不能抵抗基因III型异源毒株N28的攻击。此外,SD12-F120VC免疫小鼠血清中,针对同源SD12-F120VC和SD12的中和抗体效价高于异源N28毒株。与SD12-F120比较发现,SD12-F120VC的prM蛋白存在6个氨基酸变异,其中4个位于pr结构域,这可能与Vero细胞适应有关。综上所述,本研究比较分析了基因I型弱毒株和亲本强毒株间的表型和基因型特征差异,验证了基因I型弱毒株的保护效果,为基因I型疫苗研发提供了数据。
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