背景：“脑神经血管单元”是包括大脑神经元、胶质细胞、微血管等在内的一个整体概念,在脑神经血管疾病的研究和治疗中具有重要意义。课题组前期用原代培养的大鼠大脑皮层神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,采用Tanswell细胞培养小池,在体外初步建立了“脑神经血管单元”整体结构模型,但其方法还不够稳定成熟,对于整体结构的关联性及其与在体功能的吻合性的验证还不足。本文的研究是在前期工作基础上进行方法学的改进、稳定,使其成熟,并验证其整体结构的相互关联性及其与在体“脑神经血管单元”功能的相似性本课题获得了教育部博十学科点专项基金(博导类：20110182110012)；重庆市卫生局中医药科研重大项目(渝中医2010[60]2010-1-4)的支持。目的：1.改进并稳定建模用三种细胞的分离培养方法和神经血管单元三细胞共培养模型建立方法,为进一步研究提供稳定成熟的技术手段。2.研究细胞特异性蛋白在缺氧复氧损伤不同时间点的表达及其相互关系,验证体外建立的“脑神经血管单元”模型与在体功能的相似性。方法：1.建模用三种大鼠脑细胞分离、培养与纯化鉴定方法的改进和稳定建立大鼠脑皮层微血管内皮细胞分离、培养与纯化鉴定新方法本研究直接将25%的BSA加入获取的皮质层碎块中,匀浆后梯度离心取微血管段,用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化获取微血管内皮细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,不添加生长因子,在传代时通过差异消化法纯化,用兔抗Ⅷ因子进行鉴定。大鼠脑皮层神经元细胞分离、培养、纯化与鉴定方法的改进改进课题组前期用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,用阿糖胞苷抑制非神经元细胞生长来纯化,用神经元特异烯醇化酶(NSE)进行鉴定的方法：本研究中,采用DMEM/F12培养基添加无血清B27进行培养与纯化,用神经元特异性微管相关蛋白质2(MAP-2)进行鉴定。大鼠脑皮层星形胶质细胞分离、培养与纯化鉴定方法的稳定方法同课题组前期方法：分离新生3d内大鼠皮质层星形胶质细胞,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,通过摇瓶去除非星形胶质细胞,用兔抗GFAP鉴定。2.“脑神经血管单元”体外共培养模型建立方法的改进与稳定改变前期选用半透明transwell培养小池,神经元培养传代后接种到培养孔底,0.4mL/孔星形胶质细胞混悬液接种,培养2d后接种微血管内皮细胞的方法。本研究选用透明的transwell培养小池,神经元直接接种在培养板孔底培养纯化,在transwell膜外侧种植1mL的星形胶质细胞混悬液,贴壁后将小池插入神经元培养孔,1d后在transwell膜内侧种植纯化的脑微血管内皮细胞,共培养3d后用于模型评价和相关实验。通过倒置相差显微镜观察三种细胞生长状态、检测4h渗漏试验和跨内皮细胞电阻值,评价模型构建成功与否,评价正常培养时,该模型屏障功能与在体生理条件下的相似性。3.“脑神经血管单元”体外共培养模型氧复氧损伤方法的建立与稳定将建模成功的培养池内培养基换成无血清缺氧液,放入持续通入混合气体的、37℃恒温恒湿的缺氧装置中处理4h,再将缺氧液换成复氧液,于正常培养条件下培养。通过倒置相差显微镜观察模型中三种细胞生长状态、检测4h渗漏试验和跨内皮细胞电阻值,评价模型缺氧复氧损伤的成功与否；评价缺氧复氧损伤后,该模型屏障功能变化与在体病理条件下的相似性。4.“脑神经血管单元”体外模型缺氧复氧损伤中细胞特异性蛋白动态变化研究在缺氧前、复氧0h、复氧2h、复氧6h、复氧12h及复氧24h六个时间点分别提取不同培养方式下三种细胞蛋白,经过前处理后用WB方法检测神经元GAP-43、微血管内皮细胞Claudin-5、星形胶质细胞AQP-4的表达。通过比较上述功能蛋白在缺氧复氧损伤时表达变化与在体缺血再灌注损伤过程中表达变化,评价缺氧复氧损伤后,该模型中细胞功能变化与在体病理条件下的相似性。结果：1.方法改进后,分离培养的三种建模用新生大鼠脑原代培养细胞形态均一呈现出各自典型的生长特征。经特异性蛋白鉴定,神经元纯度达95%以上,较改进前提高10%；星形胶质细胞纯度达96%以上,较改进前提高6%；微血管内皮细胞纯度达99%以上,较改进前提高4%。改进后的脑微血管内皮细胞培养方法操作简单,耗时短,不需添加昂贵的生长因子,且节约动物使用量。2.本研究采用透明transwell膜来改进了课题组前期用半透明transwell膜建立三细胞共培养模型的方法,并优化建模中细胞种植时间、数量等条件,建立了稳定的三细胞共培养模型,不仅使建模时间缩短,而且便于直接观察细胞生长状态和拍照。三细胞共培养体中,细胞共生长良好,星形胶质细胞胞体粗大并充分伸展、微血管内皮细胞形成单层、神经元轴突形成致密的网络,基本符合在体生长形态。通过比较单细胞培养、双细胞共培养和三细胞共培养生长结果,表明三细胞共培养模型细胞之间具有明显的相互促进生长的整体协同效应。4h渗漏试验中各孔液面均无明显下降,跨内皮细胞电阻值达到268.3±6.5(Ωcm2)。表明该模型具有“脑神经血管单元”中基本的屏障功能,相似于在体“脑神经血管单元”的部分生理功能。3.缺氧复氧损伤后,三种细胞形态变化较大。脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞均不同程度出现胞体回缩,细胞间隙增加,神经元突触缩短并减少,但三细胞共培养模型中细胞形态受损程度小于双细胞共培养和单细胞培养。显示三细胞共培养体缺氧复氧损伤后,与在体脑组织缺血再灌注损伤后细胞形态变化相似,而且较单细胞或双细胞培养具有更强的抗损伤能力。与损伤前相比：三细胞共培养体4h渗漏试验降低显著(P<0.01)。跨内皮细胞电阻值为227.1±3.3(Q cm2),下降明显(P<0.01)。显示缺氧复氧损伤后。该三细胞共培养模型具有相似于在体“脑神经血管单元”缺血再灌注损伤的细胞病理变化。4.双细胞共培养和单细胞培养时,神经元GAP-43和微血管内皮细胞Claudin-5的表达在复氧后0-2h就极显著降低(P<0.001);三细胞共培养体中,神经元GAP-43在复氧后6h才开始明显降低(P<0.05),该两种蛋白在复氧后12h才达到极显著降低(P<0.001)。双细胞共培养和单细胞培养时,星形胶质细胞AQP-4的表达在复氧后0-2h就极显著升高(P<0.001)；在三细胞共培养体中,其表达在复氧后2h才显著升高(P<0.05),在复氧24h时才达到极显著升高(P<0.001)。显示缺氧复氧损伤后,三细胞共培养体与在体脑组织缺血再灌注损伤后细胞蛋白变化相似,而且较单细胞或双细胞培养具有更强的抗损伤能力。该三细胞共培养模型具有相似于在体“脑神经血管单元”缺血再灌注损伤的细胞蛋白病理变化。结论：1.本研究建立了一种新的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法,改进了大鼠脑皮层神经元原代培养方法,稳定了大鼠脑皮层星形胶质细胞原代培养方法。所获得的大鼠脑皮层三种原代细胞纯度较高,为后续研究提供了稳定的细胞培养方法,也可作为相关研究细胞培养的技术参考。2.本研究改进并稳定了“脑神经血管单元”体外模型建模方法,使建模时间缩短,且便于直接观察细胞生长状态和拍照。所建模型中的三种脑细胞具有类似于在体脑组织细胞之间相互促进生长的作用,具有生理屏障功能。显示所建立的模型具有与在体“脑神经血管单元”相似的部分生理功能。3.本研究建立了稳定的“脑神经血管单元”体外模型缺氧复氧损伤方法。该方法损伤后,“脑神经血管单元”体外模型具有相似于在体脑组织细胞的病理形态学变化特点。该方法损伤后“脑神经血管单元”体外模型中神经元GAP-43、微血管内皮细胞Claudin-5和星形胶质细胞AQP-4的表达,具有类似于在体缺血再灌注损伤后脑组织细胞蛋白的变化特点。4.与单细胞培养或者双细胞培养比较,三细胞共培养模型细胞之间具有明显的相互促进生长的整体协同效应。“脑神经血管单元”体外模型中细胞在缺氧复氧损伤条件下,更加具有类似于在体脑组织细胞之间相互保护、增强抵御损伤能力的作用。5.综上所述,本研究改建了“脑神经血管单元”体外模型。所获得的“脑神经血管单元”体外模型,较之单细胞培养或者双细胞培养模型,更具有类似于在体的“脑神经血管单元”的主要细胞成分、基本形态结构,基本生理功能、基本病理变化特点,可作为脑神经血管疾病及其治疗药物筛选的体外研究工具。