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格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)作为肠道内重要的共生菌,因其具有维持肠道菌群微生态平衡、抑制病原菌生长、缓解过敏反应等益生特性,部分菌株目前已应用于食品发酵和保健品的生产。格氏乳杆菌能够黏附定植于肠上皮细胞,介导免疫应答反应并发挥潜在益生功效,然而其对宿主体内免疫相关基因的诱导情况和具体的调节机制尚不清楚。由于益生菌的功能特性存在明显的菌株和宿主特异性,因此深入解析格氏乳杆菌在肠上皮细胞中的免疫调节作用及信号转导途径对该菌种的应用和开发具有重要意义。本研究以分离自健康婴儿粪便的格氏乳杆菌JM1(L.gasseri JM1)为研究对象,对其环境耐受性、黏附能力、抑制病原菌黏附等基本益生特性进行评价,通过构建Caco-2细胞模型,对其作用于宿主细胞后免疫相关基因的表达和信号转导通路进行探究。利用全基因组测序技术分析该菌株的基因组信息,并为进一步阐释其生物学特性提供遗传学基础。通过上述研究得到如下结果:(1)L.gasseri JM1具有良好的胃肠道环境耐受性。L.gasseri JM1在p H 3.0和p H 2.0条件下培养3 h后,活菌数均达7.00 lg cfu/m L以上,菌株存活率分别为96.06%和95.44%;L.gasseri JM1在胆盐浓度为0.3%、0.5%和1.0%条件下培养4 h后,菌株存活率分别为85.93%、82.97%和77.94%;L.gasseri JM1在模拟人工胃液中培养3 h,随后将菌株接种到模拟人工肠液中培养8 h,活菌数为7.04 lg cfu/m L,菌株存活率为87.00%。结果表明,L.gasseri JM1具有良好的酸、胆盐、模拟人工胃肠液耐受性,可以较好的在机体胃肠道内定植。(2)L.gasseri JM1具有较强的黏附于肠上皮细胞和抑制病原菌黏附能力。采用平板涂布法对L.gasseri JM1黏附于Caco-2细胞的能力进行评价,发现L.gasseri JM1的黏附数达7.56 lg cfu/m L,显著高于大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922对肠上皮细胞的黏附数6.85lg cfu/m L(p<0.05);通过排斥、竞争和置换试验发现,L.gasseri JM1能够抑制E.coli ATCC25922对Caco-2细胞的黏附作用,抑制率分别为7.56%、12.40%和6.21%。(3)L.gasseri JM1对肠上皮细胞具有免疫调节作用。当不同浓度L.gasseri JM1菌悬液作用于Caco-2细胞6 h后,利用real-time RT-PCR技术检测宿主细胞中免疫相关基因的m RNA表达水平,发现该菌株能够刺激宿主细胞内IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和TGF-β3基因的表达,而抑制IL-1β和IL-8基因的表达,并且m RNA的表达量随浓度的变化而不同。(4)L.gasseri JM1对脂多糖(LPS)诱导的炎症细胞具有免疫保护作用。通过构建体外肠上皮细胞炎症模型,利用L.gasseri JM1预处理Caco-2细胞6 h,再以LPS刺激细胞2 h,发现L.gasseri JM1预处理可以显著降低由LPS诱导的促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的m RNA表达水平(p<0.05),显著提高细胞中抗炎性细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β3的m RNA表达水平(p<0.05)。(5)L.gasseri JM1通过激活Toll样受体-2(TLR2)和Nod样受体-2(NOD2)介导的PI3K/Akt信号通路从而发挥免疫调节功能。当1×10~8 cfu/m L L.gasseri JM1作用于Caco-2细胞6 h后,利用real-time RT-PCR技术检测宿主细胞中模式识别受体表达水平,发现该菌株可极显著地刺激细胞中TLR2和NOD2的m RNA表达(p<0.01);随后分别对对照样品和L.gasseri JM1处理样品的转录组测序数据进行对比分析,共获得84个显著差异表达基因(p<0.05,fold change>1),其中上调基因72个,下调基因12个,与免疫调节作用最为相关的基因分别为CHAD、ITGA9、AKT3、COL1A1、PCK1和PIK3C,pathway分析表明,这些差异表达基因显著富集于PI3K/Akt信号通路(p<0.01)。(6)明确了L.gasseri JM1基因组特征及功能基因。L.gasseri JM1基因组由1条环状染色体和2个质粒组成,其中染色体长度为1,996,913 bp,GC含量为34.93%,质粒长度分别为44,217 bp和44,285 bp,GC含量分别为42.30%和34.35%;基因组共含2162个编码基因、15个r RNA操纵子、73个t RNA基因、5个s RNA以及3个编码细菌素的基因簇。此外,L.gasseri JM1基因组上存在营养物质代谢、耐酸、耐胆盐、黏附以及应激相关的基因。比较基因组分析显示,该菌株共编码202个特异基因,与L.gasseri ATCC 33323~T共线性极高,与L.gasseri 4M13和L.gasseri K7亲缘关系较近,是一株潜在的益生菌候选株。