蛋白质组学是后基因组时代的一个新兴领域，其理论和技术的发展为肿瘤标志物的研究提供了新的方向。临床研究显示，对恶性肿瘤而言早期诊断的意义远大于现有的任何一种治疗方案，但现有常用标志物对早期无症状阶段肿瘤的及时发现能力仍远不能令人满意。所以寻找灵敏度、特异度均高，检测方便，无创的标志物用于肿瘤早期发现、早期诊断己成为当务之急。蛋白质组学研究的关键在于蛋白质的分离和鉴定，如何有效去除样品中高丰度蛋白，分离富集低丰度蛋白，这不仅是蛋白质组学样品制备重要的研究内容，也是制约蛋白质组学发展的瓶颈问题。近年来，多维液相色谱(multidimensional HPLC，MDLC)以其分离效率高、重复性好、方法灵活多样，且易与质谱联用实现自动化的特点，广泛应用于蛋白质组学研究。本研究应用多维色谱和基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time 0fflight mass spectrometry,MADLI-TOF MS)离线联用对人血清蛋白质组学样本分离和检测，并通过该技术筛选了胰腺癌患者血清和组织中的差异表达蛋白质，取得了比较满意的结果。 本论文包括以下四个部分： 1.文献综述。概括的介绍了蛋白质组学及其研究的内容、方法以及研究现状，以及目前蛋白质组学在胰腺癌的研究进展以及重要意义。 2.疏水型色谱饼对人血清蛋白质组学样品的快速分离与制备。建立了疏水型色谱饼(10 mm×20 mm LD.)与反相色谱(RPLC)离线二维色谱快速分离制备人血清蛋白质组学样品，并用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测的方法。以四种标准蛋白的稀溶液为模型进行分离富集，得到细胞色素-C(Cyt-C)与肌红蛋白(Myo)的检出限均为1 pmol· L-1，溶菌酶(Lys)和胰岛素(Ins)为0.1 pmol·uL-1。将此方法用于人血清蛋白质组学样品的分离与制备，随着血清处理量增大，质谱可检出组分与其信号强度均增加，当血清处理量达到l mL时，可检出低丰度蛋白质或多肽285个(15 kDa以下)。研究中以Cyt-C为内标，将其1 g加入到0.5 mL血清中，用上述方法在分离富集所加入的低丰度Cyt-C上取得了很好的效果。以上结果表明，用疏水型色谱饼与RPLC二维色谱联用技术不仅可对血清样品中低丰度蛋白进行有效的分离和富集，而且一次样品处理量大，显著提高了低丰度蛋白的分析、检测水平。 3.离线体积排阻.反相色谱.质谱(SEC-RPLc-MS)对胰腺癌患者血清肿瘤标志物筛选的研究。用体积排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)对变性后血清中的蛋白按其分子量的大小进行分离并富集，从而消除了高丰度大分子量蛋白质对小分子量蛋白/多肽的影响，提高了低丰度小分子量蛋白的检出率。经过反相色谱(reverse phase chromatography,RPLC)进一步分离后，并用MALDI-TOF MS在未酶解的情况下直接分析检测。结果显示：该技术手段重复性高、稳定性好，是较为理想的血清蛋白质组学研究平台，通过对胰腺癌患者术前、术后血清的实验结果对比分析，并以健康人血清检测结果作为对照，筛选出一种显著差异蛋白分子。这一m/z为5734 D的蛋白质/多肽在胰腺癌患者血清中呈现明显上调，敏感度达到78.38％(29/37)，特异度达到100％(6/6)，有望作为胰腺癌诊断的标志物。 4.离线SEC-RPLC-MS对胰腺癌变组织蛋白质组样品的研究。用SEC-RPLC分别对使用两种不同方法提取的胰腺癌组织样品进行分离，并用MALDI-TOF MS检测，优化选择提取效果较好的一种方法，可检出240余种不同质荷比的蛋白/多肽分子，该技术方法灵活简便，可用作组织蛋白质组研究的通用型方法。通过对11例胰腺癌组织及2例正常胰腺组织的研究，发现一些差异表达蛋白，并且在癌变组织样本中检测到m/z是5734D的蛋白质/多肽的质谱信号，这些蛋白可能成为胰腺癌的蛋白标志物。