目的宫颈癌的发病趋势已呈现低龄化。白介素-10(IL-10)作为一种具有免疫抑制作用的细胞因子对宫颈癌变的发生、发展具有重要作用。当其在人体内大量合成可抑制免疫系统的调控,引起HPV病毒入侵,导致宫颈癌的发生。在宫颈肿瘤生长的微环境中,肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)通过分泌多种细胞因子参与肿瘤的生长、侵袭和迁移。TAMs作为表达IL-10的主要来源之一,其在宫颈癌变中调控IL-10表达的分子机制未曾报道。课题组前期研究已证实,宫颈肿瘤局部组织IL-10表达明显升高,且该基因启动子的低甲基化修饰促进其表达,这提示DNA甲基化修饰在应对病毒入侵和局部炎症环境的变化过程中具有重要影响。生物信息学分析显示:E26转录因子-1(Ets1)和特异性蛋白1(Sp1)在IL-10基因启动子上结合的顺式作用元件含有CG位点,且有报道称Ets1和Sp1的表达与宫颈癌的发生相关,但其是否参与TAMs表达IL-10的调控机制及其在宫颈癌中的作用研究未见报道。因此,本研究利用人单核巨噬细胞、人宫颈癌细胞和人不同病理宫颈组织,探讨TAMs中DNA甲基化参与Ets1和或Sp1介导IL-10基因转录调控的分子机制及其在宫颈癌变中的作用,旨在为以TAMs作为靶点的宫颈癌靶向治疗提供新思路。方法选取2014年9月至2016年3月就诊于唐山市工人医院并行宫颈活检及手术治疗患者160例,其中正常宫颈47例(对照组)、子宫颈上皮内瘤变Ⅰ级27例(CINⅠ组)、子宫颈上皮内瘤变Ⅱ-Ⅲ级46例(CINⅡ-Ⅲ组)和宫颈鳞癌40例(CSCC组)。在线查看所有患者的电子病例并了解患者的基本信息情况。采用免疫双荧光染色检测各组人宫颈组织中IL-10、Ets1和Sp1分别同CD68的共表达;临床分析IL-10+TAMs、Ets1+TAMs和Sp1+TAMs水平与宫颈鳞癌临床病理特征的关系;采用人单核细胞THP-1体外诱导形成宫颈TAMs;利用si RNA干扰以及q RT-PCR和Western blot技术分析TAMs中转录因子Ets1和(或)Sp1对IL-10基因表达水平的影响;生物信息学分析转录因子Sp1和Ets1在IL-10基因启动子近端2000bp范围内可能的结合位点,并通过对TAMs甲基化干预、荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀(CHIP)和甲基化特异性PCR(MSP)等分子生物学方法分析在宫颈TAMs中DNA甲基化对转录因子Sp1、Ets1与IL-10基因启动子的结合及其转录活性的影响。结果1对照组、CINⅠ组、CINⅡ-Ⅲ组和CSCC组患者的基本信息(包括:年龄、初潮年龄、月经周期、经期天数、怀孕次数、流产次数、吸烟情况、饮酒情况)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2免疫双荧光染色检测不同病理宫颈组织中IL-10、Ets1和Sp1与TAMs的共表达结果显示,伴随宫颈病变的进展,宫颈组织中TAMs以及IL-10+TAMs、Ets1+TAMs和Sp1+TAMs的表达百分比均逐渐增加,且与正常组相比,CINⅠ组、CINⅡ-Ⅲ组和CSCC组中的表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3在CSCC组织中IL-10+TAMs、Ets1+TAMs和Sp1+TAMs的表达水平与年龄、肿瘤大小无关(P>0.05);与分化程度、FIGO分期和淋巴结转移有关(P<0.05)。4在TAMs中采用干扰si RNA敲低Ets1、Sp1或同时敲低Ets1和Sp1基因表达,q RT-PCR和Western blot实验结果显示:敲低Sp1或同时敲低Ets1和Sp1基因均可下调IL-10的表达,且双敲抑制其表达更为明显,而仅敲低Ets1对IL-10的表达影响较小。5在甲基化干预实验以及MSP测序和Ch IP实验结果显示,在TAMs中IL-10基因启动子区的去甲基化促使转录因子Sp1与其结合并上调IL-10的表达。6进一步CHIP和免疫荧光染色实验结果表明,Ets1在Sp1调控IL-10基因启动子活性过程中起协同作用。结论1 TAMs源IL-10的表达与宫颈癌变呈正相关性。2在宫颈癌中转录因子Ets1和Sp1的表达上调且与TAMs源IL-10的表达相关。3在TAMs中Sp1结合位点DNA去甲基化在调控IL-10基因启动子活性及其在宫颈癌变发生中具有重要促进作用,而Ets1表达促进Sp1调控IL-10基因启动子的转录活性。