目的1、建立具有糖尿病性损害特点的雪旺细胞模型;此细胞模型可作为治疗糖尿病神经病有效药物筛选及其机理研究的实验工具和检测体系。2、进一步观察高糖条件下雪旺细胞功能的变化特点,为阐明糖尿病神经病的发病机理提供直接的实验依据。3、观察中药提取物烯甙是否具有改善雪旺细胞实验性糖尿病性损伤的作用。4、探讨烯甙发挥作用的可能机制,为中医药的现代化以及中医理论的创新积累实验资料。方法1、雪旺细胞的分离、培养与鉴定:采用brockes改良法从新生wistar乳鼠坐骨神经组织分离纯化雪旺细胞,并以10%胎牛血清和含0.1%GS(5.0mmol/L)的DMEM培养液培养。鉴定方法:将细胞贴壁于载玻片上,经固定(10%福尔马林5分钟)后分别采用抗S100和抗MBP的免疫细胞化学染色(ABC法)和苏木素复染,计算免疫染色着色细胞的阳性率。2、高糖培养对雪旺细胞活性与增殖能力的影响雪旺细胞贴壁培养后弃培养液,分为正常组、高糖组和高糖高渗组,分别采用含正糖(5.0 mmol/L GS)、高糖(30.0 mmol/L Gs)和高糖高渗(含30.0 mmol/LGS+100 mmol/L NaCl)的培养液培养48小时。采用XTT法测定三组不同培养条件的雪旺细胞活性:各组细胞每孔加50ulXTT/PMS应用液,避光振摇培养4h后,在酶标仪以450-500nm波长测定各孔OD值。采用~3H-TdR掺入法检测三组不同条件培养雪旺细胞的增殖能力;各组细胞每孔分别加入0.5uci/10ul的~3H-TdR,继续培养16小时。细胞裂解处理后取裂解液100ul加于含有4ml闪烁液的检测瓶中,在闪烁计数仪上检测CPM读数。3、烯甙对高糖培养雪旺细胞活性与增殖能力的影响雪旺细胞贴壁培养后弃培养液,分为正常组(LG)、高糖组(HG)、烯甙组和参麦组;分别加入含正糖(5.0 mmol/L GS)、高糖(30.0 mmol/L GS)、高糖加烯甙(30.0 mmol/L GS+8mg/ml稀甙)、高糖加参麦(30.0 mmol/L GS+10mg/ml参麦)的培养液培养,48小时后四组分别采用XTT法和~3H-TdR掺入法测定雪旺细胞的活性和增殖能力,并记录检测结果。4、烯甙对高糖培养雪旺细胞增殖能力、NGF的表达与合成影响的观察雪旺细胞贴壁培养12小时后弃培养液,分为正常组(LG)、高糖组(HG)、烯甙组和参麦组;各组分别加入含正糖(5.0 mmol/L GS)、高糖(30.0 mmol/lGS)、高糖加烯甙(30.0 mmol/L GS+8mg/ml烯甙)、高糖加参麦(30.0 mmol/L GS+10mg/ml参麦)的培养液培养,48小时后四组分别收集上清液采用Elisa法测定NGF的合成水平。收集雪旺细胞分别采用~3H-TdR掺入法测定雪旺细胞的增殖能力,采用实时萤光定量PCR法检测各组雪旺细胞NGFmRNA的表达水平。结果1、雪旺细胞的分离、培养与鉴定从Wistar乳鼠坐骨神经分离雪旺细胞,每只大鼠原代约可取得1×10~6个细胞;高倍镜下观察,细胞胞体较小,大多数成梭形。取样经ABC法染色,抗S100和抗MBP染色着色细胞阳性率分别为92±2%和93±3%(N=10),两种方法阳性率比较无显著差异。2、高糖培养对雪旺细胞活性和增殖能力的影响采用XTT法检测雪旺细胞活性;高糖组同正常组比较,细胞活性明显降低,差别具有显著性(P＜0.05);高糖高渗组同正常组比较,细胞活性更低(P＜0.01);高糖组与高糖高渗组比较,差别也具有极显著意义。表明高糖对雪旺细胞活性具有显著抑制作用,但较高渗存在时为轻。采用~3H-TdR掺入法检测雪旺细胞增殖能力;高糖组同正常组比较,细胞增殖能力明显抑制,差别具有极显著性(P＜0.01);高糖高渗组与正常组比较,细胞增殖能力也明显抑制,差别具有极显著性(P＜0.01);高糖组与高糖高渗组比较,差别也具有极显著意义。表明高糖培养对于雪旺细胞功能具有抑制性作用,但程度较高渗存在时为轻。3、烯甙对高糖培养雪旺细胞活性与增殖能力变化的影响采用XTT法检测雪旺细胞活性;高糖组同正常组比较,细胞活性明显降低,差别具有极显著性(P＜0.01);烯甙组同高糖组比较,细胞活性无明显改善,差别无显著性(P＜0.05);参麦组同高糖组比较,细胞活性也无明显改善,差别无显著性。表明烯甙和参麦组治疗对高糖导致的细胞活性下降无显著改善作用。采用~3H-TdR掺入法检测雪旺细胞增殖能力;高糖组同正常组比较,细胞增殖能力明显下降,差别具有显著性(P＜0.01);烯甙组与高糖组比较,细胞增殖能力明显改善,差别具有显著性(P＜0.01);而参麦组与高糖组比较差别无显著性(P＞0.05)。表明烯甙对高糖条件下雪旺细胞增殖能力的抑制性变化具有显著的改善作用。4、烯甙对高糖条件下雪旺细胞增殖能力,NGF表达与合成变化的影响如前所述,烯甙对高糖条件下雪旺细胞增殖能力的抑制性改变具有显著改善作用,而参麦则无明显影响。高糖组与正常组比较、NGF合成显著减少(P＜0.01),表明高糖对雪旺细胞的增殖能力以及NGF的合成均具抑制作用;烯甙组与高糖组比较,NGF的合成功能明显改善(P＜0.01)。同时NGFmRNA的表达也显著上调(P＜0.01),表明烯甙对高糖时雪旺细胞的增殖能力、NGF表达及合成损害均具有改善作用。参麦组同高糖组比较则无显著差异(P＞0.05),表明参麦治疗对雪旺细胞的增殖能力、NGF合成与表达无明显影响。结论1、采用brockes改良法从新生wistar乳鼠双侧坐骨神经分离雪旺细胞,每只乳鼠分离细胞数可达1×10~6个细胞(原代),分别应用抗S100和抗MBP免疫染色(ABC法)鉴定,阳性率均大于90%,表明此种分离雪旺细胞的方法无论是效率还是纯度,均能满足实验研究的需要。2、高糖培养对雪旺细胞的活性和增殖能力均具有显著的抑制作用,表明高糖培养的雪旺细胞作为实验性糖尿病性损伤的细胞模型已达到成模要求;进一步研究其病理改变特征,可帮助我们从一个侧面来了解糖尿病神经病的发病机制,并可用作有效药物筛选的实验工具和检测体系。3、烯甙对高糖雪旺细胞的活性变化虽未产生作用,但对其增殖能力的抑制性变化却具有显著的改善作用,而对照治疗药物参麦则无此作用。4、烯甙对高糖条件下雪旺细胞的增殖能力、NGF表达与合成影响的同步观察显示:(1)高糖条件下雪旺细胞在增殖能力发生显著变化的同时,其NGF的合成也发生显著的变化,表现为NGF合成下降,其病理意义十分明显。(2)烯甙可使高糖条件下雪旺细胞的增殖能力、NGF的合成的抑制变化同时得到明显改善以及NGFmRNA表达上调。由于NGF介导的信号转导通路与雪旺细胞的增殖活动密切相关,所以,有理由推测烯甙有可能通过影响NGF合成与作用的某个环节,并经由其介导的胞内信号级联机制,逆转高糖培养下雪旺细胞增殖能力的下降,这对于雪旺细胞在病理环境中发挥救他与自救潜能将有重要帮助。