【摘 要】
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SUMO化是细胞中一种重要的蛋白质类翻译后修饰系统。SUMOs是一类分子量约11k Da的小蛋白,通过E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶三种类泛素化相关酶的级联催化反应将SUMO分子C末端的羧基和底物蛋白上Lys残基共价连接形成异肽键,这一过程可被去SUMO化酶所逆转。SUMO2/3的N末端具有ΨKXE结构,其可作为SUMO的附着位点,从而形成多聚SUMO链。SUMO化修饰在DNA损伤修复、细胞周
【基金项目】
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2013年~2016年,MDV编码的去泛素化酶ML36的调节通路及致瘤机制研究,国家自然科学基金（批准号 31272528）； 2018年~2020年,去泛素化酶ML36抑制剂的筛选及其抗MDV作用的研究,吉林省自然科学基金（批准号 20180101244JC）；
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SUMO化是细胞中一种重要的蛋白质类翻译后修饰系统。SUMOs是一类分子量约11k Da的小蛋白,通过E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶三种类泛素化相关酶的级联催化反应将SUMO分子C末端的羧基和底物蛋白上Lys残基共价连接形成异肽键,这一过程可被去SUMO化酶所逆转。SUMO2/3的N末端具有ΨKXE结构,其可作为SUMO的附着位点,从而形成多聚SUMO链。SUMO化修饰在DNA损伤修复、细胞周期调控、肿瘤的发生、炎症的发展等过程中发挥重要的作用。聚泛素链有8种,其中一种为线性（M1）泛素链,而在多聚SUMO链中,目前并未发现这种类型。本研究根据前期在Ub研究方向发明的构建策略,确定了一种SUMO线性链的构建策略,并制备了重组SUMO链,以期为探索细胞内线性SUMO化修饰提供研究材料,也给SENP酶活性分析、SENP与SUMO底物互作研究提供研究材料,也为进一步的SUMO化修饰及其功能研究奠定了材料及技术基础。本研究首先构建了两个基础质粒p MD18TM-SUMO2/3-1st和p MD18TM-SUMO2/3-2nd。再进行线性链的延伸:将p MD18TM-SUMO2/3-2nd经Sac I（酶切位点“GAGCT│C”）酶切后,利用T4 DNA聚合酶的3’外切酶活性将Sac I酶切后的粘性末端水解成平端,再经Hind III处理后得到单SUMO2/3基因片段“C-SUMO2/3”,将其插入p MD18TM-SUMO2/3-1st载体的Stu I（酶切位点“AGG│CCT”）与Hind III两位点之中,构成含有两个单SUMO2/3相连的线性链基因,称之为SUMO2/3-L2,经循环重复,本研究成功构建了含有2～4个长度的线性SUMO2/3链基因片段的表达载体。将此线性SUMO2/3链在原核表达系统中进行了表达纯化,并用特异性蛋白酶SENP1/2确定了这些SUMO链的底物活性。结果发现,不同长度的线性SUMO2/3链基因均可正确表达并被纯化出来;SENP1/2能够水解2～4个长度的线性SUMO2/3链。这些结果表明本研究制备的线性SUMO2/3链具有底物活性,为进一步探究线性SUMO2/3链的功能研究奠定了基础。
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