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光温敏核不育系水稻(Photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile, PTGMS)的花粉育性可在光周期、温度影响下发生明显的转换，研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在其育性转换中起重要的调控作用。lncRNAs是一类长度超过200nt的调控性非编码RNA转录本，通过多种机制参与调控植物中多种生物学过程。其中一种机制是lncRNA通过靶标模拟结合并隔离特定的microRNA(miRNA)来起竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)的作用，进而间接调控靶基因的表达。目前在多种高等植物中均预测到了许多可作为ceRNA的lncRNA，但只有少数经过实验验证，而在其调控PTGMS水稻育性转换的研究还未有详细的报道。
在本实验室的前期研究中，对光温敏核不育水稻武香S(Wuxiang S, WXS)育性转换关键时期的幼穗进行RNA测序，筛选到一些显著性差异表达的lncRNA，并分析预测出这些lncRNA介导的ceRNA网络。为了进一步了解lncRNA在WXS育性转换中的分子机制以及调控网络，本研究选取其中一组：lncRNA(MSTRG.100908.3)-miR160a-ARF10/ARF22进行ceRNA网络研究，主要从ceRNA网络中三者的表达量相关性分析、MSTRG.100908.3的非编码验证、三者调控关系验证三方面着手研究。主要研究结果如下：
1、通过实时定量PCR分析lncRNA(MSTRG.100908.3 )、osa-miR160a、ARF10/ARF22在WXS幼穗三个发育时期(P2、P3、P4)中的表达情况。实验结果表明，该lncRNA在可育株(WXS-F)中的表达水平显著高于不育株(WXS-S)。此外在WXS-F幼穗的三个不同发育时期中，MSTRG.100908.3与ARF10/ARF22的表达呈正相关关系，而osa-miR160a与MSTRG.100908.3和ARF10/22的表达呈负相关关系。
2、通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了MSTRG.100908.3的全长序列，一共2852bp。利用ORFFinder、pfam、CPC2对其编码潜能进行分析，结果显示该lncRNA最长的ORF编码产物小于100个氨基酸，且与已知蛋白质数据库进行检索比对，表明该ORF不具有蛋白质编码潜能，说明MSTRG.100908.3是一个长链非编码RNA。
3、将MSTRG.100908.3序列分为两段，设计具有反向互补核苷酸的内部引物，进行重叠延伸PCR获得了MSTRG.100908.3的测序序列。然后将MSTRG.100908.3的测序序列和osa-miR160a前体序列分别构建到植物过表达载体上；将ARF10和ARF22的CDS(coding sequence)区序列分别构建到植物表达荧光素酶报告载体上。利用重组的荧光素酶报告载体和过表达载体共转染水稻WXS的原生质体，实验结果表明，osa-miR160a可以下调ARF10/ARF22的表达，而MSTRG.100908.3可作为ceRNA结合osa-miR160a，从而间接上调ARF10/ARF22的表达。
在本实验室的前期研究中，对光温敏核不育水稻武香S(Wuxiang S, WXS)育性转换关键时期的幼穗进行RNA测序，筛选到一些显著性差异表达的lncRNA，并分析预测出这些lncRNA介导的ceRNA网络。为了进一步了解lncRNA在WXS育性转换中的分子机制以及调控网络，本研究选取其中一组：lncRNA(MSTRG.100908.3)-miR160a-ARF10/ARF22进行ceRNA网络研究，主要从ceRNA网络中三者的表达量相关性分析、MSTRG.100908.3的非编码验证、三者调控关系验证三方面着手研究。主要研究结果如下：
1、通过实时定量PCR分析lncRNA(MSTRG.100908.3 )、osa-miR160a、ARF10/ARF22在WXS幼穗三个发育时期(P2、P3、P4)中的表达情况。实验结果表明，该lncRNA在可育株(WXS-F)中的表达水平显著高于不育株(WXS-S)。此外在WXS-F幼穗的三个不同发育时期中，MSTRG.100908.3与ARF10/ARF22的表达呈正相关关系，而osa-miR160a与MSTRG.100908.3和ARF10/22的表达呈负相关关系。
2、通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了MSTRG.100908.3的全长序列，一共2852bp。利用ORFFinder、pfam、CPC2对其编码潜能进行分析，结果显示该lncRNA最长的ORF编码产物小于100个氨基酸，且与已知蛋白质数据库进行检索比对，表明该ORF不具有蛋白质编码潜能，说明MSTRG.100908.3是一个长链非编码RNA。
3、将MSTRG.100908.3序列分为两段，设计具有反向互补核苷酸的内部引物，进行重叠延伸PCR获得了MSTRG.100908.3的测序序列。然后将MSTRG.100908.3的测序序列和osa-miR160a前体序列分别构建到植物过表达载体上；将ARF10和ARF22的CDS(coding sequence)区序列分别构建到植物表达荧光素酶报告载体上。利用重组的荧光素酶报告载体和过表达载体共转染水稻WXS的原生质体，实验结果表明，osa-miR160a可以下调ARF10/ARF22的表达，而MSTRG.100908.3可作为ceRNA结合osa-miR160a，从而间接上调ARF10/ARF22的表达。