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研究背景及目的结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和肿瘤相关死亡率均居世界前列。近年来,随着人们生活方式和饮食结构的改变,世界范围内结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势。转移是引起结直肠癌患者死亡的主要原因,由于结直肠癌发病初期表现通常较为隐匿,不容易察觉,而一旦确诊,往往已经到了中后期,这就使得患者预后生存率较低。然而结直肠癌的发病机制尚未完全阐明,大量研究表明结直肠癌的发生发展与遗传因素及环境因素等有关。因此,研究与结直肠癌发生及发展相关的分子标志物,探讨其作用机制对结直肠癌的早期诊断、治疗及预后评估具有极其重要的意义。核糖体连接蛋白 1（Endoplasmic reticulum ribosome-binding protein 1,RRBP1）也称作RRp、hES、ES130、ES/130。RRBP1基因编码一种核糖体连接蛋白,该蛋白属于粗面内质网蛋白,能与高尔基体共同参与多核糖体的组装和蛋白质的合成,并能调控哺乳动物细胞内部蛋白的运输和分泌。同时,RRBP1与膜的生物发生有关,其过表达通过减缓内质网应激,有助于癌细胞的存活。近年来研究表明RRBP1表达与肺癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生及发展密切有关。然而,RRBP1在结直肠癌中的研究较少,其生物学功能及其作用的分子机制尚不明确。本研究旨在探讨RRBP1在结直肠癌中的表达及其临床意义,并分析其生物学功能及其机制,阐明RRBP1与结直肠癌之间的关系。研究方法1.RRBP1在结直肠癌中的表达及临床意义（1）收集20对新鲜冰冻结直肠癌及配对癌旁正常组织,qRT-PCR检测RRBP1的表达情况,分析RRBP1在结直肠癌中表达改变及临床意义。（2）利用免疫组织化学染色检测30例结直肠癌及癌旁正常组织中RRBP1的表达情况,并分析其表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系,探讨RRBP1表达的临床病理学意义。2.RRBP1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响（1）在8株人结直肠癌细胞株中,利用qRT-PCR和Western blot实验检测RRBP1的内源性表达。（2）分别转染4个商品化的RRBP1 SiRNAs干扰片段至内源性RRBP1高表达的结直肠癌细胞株SW620及HT29中,利用qRT-PCR及Western blot检测干扰效率并筛选出干扰效率最高的干扰片段。构建RRBP1慢病毒干扰载体,建立RRBP1 稳定敲低细胞株 SW620.shRRBP1,SW620.SCR 及 HT29.shRRBP1,HT29.SCR,并利用Western blot验证其干扰效率。（3）将RRBP1过表达质粒转染至内源性低表达的两株结直肠癌细胞株SW480及HCT116中,利用Western blot验证其转染效率。（4）利用Transwell小室迁移实验、划痕实验分析RRBP1干扰或过表达对结直肠癌细胞株迁移等生物学行为的影响。3.RRBP1促进结直肠癌迁移的分子机制的初步研究通过Western blot分别检测RRBP1干扰及过表达后,EMT相关蛋白的表达情况,探讨RRBP1促进结直肠癌迁移的分子机制。研究结果1.RRBP1在结直肠癌中的表达及临床意义（1）利用qRT-PCR检测了 20对配对新鲜结直肠癌及癌旁正常组织中RRBP1的表达,结果显示RRBP1在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常结直肠组织（t=10.627,P=0.000）,提示RRBP1表达与结直肠癌发生发展相关。（2）应用免疫组织化学染色检测30例结直肠癌及配对癌旁正常组织中RRBP1的表达情况,结果显示:RRBP1蛋白阳性表达定位于细胞浆,在结直肠癌组织中的阳性表达率明显高于正常结直肠组织（χ2=24.093,P=0.000）。同时,RRBP1在结直肠癌组织中的表达与淋巴结转移显著相关（P=0.024）,而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤的分化程度及远处转移均无明显相关关系（P＞0.05）。2.RRBP1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响2.1构建RRBP1敲低与过表达细胞株并验证转染效率（1）在8株人结直肠癌细胞株中,qRT-PCR和Western blot结果均显示,RRBP1在SW620及HT29中表达较高,在SW480及HCT116中表达较低。（2）选取干扰效率最高的干扰片段构建慢病毒载体,构建RRBP1稳定干扰细胞株,Western blot结果显示RRBP1在结直肠癌细胞株SW620.shRRBP1及HT29.shRRBP1中的表达明显低于SW620.SCR及HT29.SCR,说明RRBP1稳定干扰细胞株构建成功。（3）转染RRBP1过表达质粒及对照质粒至内源性RRBP1低表达的结直肠癌细胞株SW480及HCT116中,Western blot检测结果表明RRBP1在结直肠癌细胞株SW480.RRBP1、HCT116.RRBP1中的表达均明显高于SW480.Mock、HCT116.Mock,提示RRBP1过表达细胞株构建成功。2.2 RRBP1干扰或过表达对结直肠癌细胞株体外生物学行为的影响（1）Transwell小室实验检测RRBP1过表达后,HCT116和SW480结直肠癌细胞株中RRBP1过表达组与对照组间相比,穿膜的细胞数目明显增多（t=-16.252,P=0.000;t=-7.792,P=0.001）,提示RRBP1高表达能促进结直肠癌细胞的体外迁移能力。（2）划痕实验结果显示:RRBP1干扰48h后,SW620和HT29结直肠癌细胞株对照组较干扰组划痕区域明显变窄,提示RRBP1干扰能抑制结直肠癌细胞的体外迁移能力。RRBP1过表达48h后,SW480和HCT116结直肠癌细胞过表达组较对照组划痕区域明显变窄,提示RRBP1过表达有助于结直肠癌细胞的体外迁移能力。3.RRBP1促进结直肠癌迁移的分子机制的初步研究为进一步揭示RRBP1促进结直肠癌细胞迁移的具体机制,我们进一步分析了 RRBP1干扰或过表达后结直肠癌细胞EMT相关蛋白的表达变化,Western blot检测结果显示:在SW620和HT29结直肠癌细胞中,与对照组相比,干扰组SW620.shRRBP1 和 HT29.RRBP1 细胞 beta-catenin、Vimentin 和 N-cadherin 表达下调,E-cadherin表达上调。而在SW480和HCT116结直肠癌细胞中,与对照组相比,RRBP1 过表达后,SW480.RRBP1 和 HCT116.RRBP1 细胞 beta-catenin vimentin和N-cadherin表达上调,E-cadherin表达下调。提示RRBP1能促进结直肠癌细胞的EMT转化,从而促进结直肠癌细胞的迁移能力。研究结论1.与正常结直肠组织相比,RRBP1在结直肠癌中高表达,其表达与结直肠癌的发生及发展相关。2.RRBP1能促结直肠癌细胞迁移。3.RRBP1促进结直肠癌细胞的迁移作用可能是通过促进EMT转化来实现的。