巨噬细胞的脂质代谢紊乱在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的形成中起关键作用，血管内膜下巨噬泡沫细胞募集是AS形成和发展中的早期病理变化。巨噬细胞通过低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，LDL-R)途径摄取血浆和间质液中氧化型LDL(oxidizedLDL，oxLDL)，由于这条途径不存在负反馈调控机制，造成细胞内大量脂质蓄积，最终导致泡沫细胞的形成。因而阻断巨噬细胞转化为泡沫细胞，是抗AS的主要的作用环节之一。 本研究的目的在于探讨ABCA1作为胆固醇外流的关键作用因子，是否介导LPC诱导的巨噬泡沫细胞胆固醇外流；在此基础上进一步研究LXRα-ABCA1途径是否在LPC诱导的巨噬泡沫细胞胆固醇外流中发挥作用，以及LPC是否通过LXRα-ABCA1途径诱导apoE作为ABCA1转运出的胆固醇接受体从而促进胆固醇外流，同时为进一步阐明ABCA1的调控机制，利用酵母单杂交初步筛选可与ABCA1启动子上DR-4顺式元件结合的特异性蛋白cDNA克隆，为将来开发利用ABCA1作为AS治疗的靶受体提供实验基础。 研究方法： 1.巨噬泡沫细胞模型的建立及胆固醇外流检测巨噬细胞取自NIH小鼠或apoE基因缺陷小鼠腹腔，进行原代培养；健康人血浆经超速离心分离制得LDL，用硫酸铜对LDL进行氧化修饰，制备的oxLDL与细胞孵育48h，使细胞转变为巨噬泡沫细胞。采用油红O染色法检测泡沫细胞内的脂质。 用酶学荧光法检测细胞内总胆固醇含量及培养基的游离胆固醇含量，以细胞内总胆固醇含量减少及培养基的游离胆固醇含量增加作为胆固醇外流增加的评价指标；以细胞内总胆固醇含量上升及培养基的游离胆固醇含量下降作为胆固醇外流减少或受抑制的评价指标。 2.LPC诱导巨噬泡沫细胞胆固醇外流LPC分为10、20、40、80μM4个组，分别与泡沫细胞共孵育24h；另外用ABCA1、LXRα的抑制剂先阻断12h、24h后，再用40μMLPC诱导后，检测胆固醇外流。 3.ABCA1、LXRα基因表达的检测用Real-timePCR检测各基因的mRNA表达；用Westernblot测定各基因的蛋白表达水平。 4.诱饵质粒的构建与报告酵母的制备设计并人工合成三串连的人ABCA1基因启动子上的DR-4片段，定向插入DNA-BD载体，通过DNA测序的方法鉴定正确重组子；将携带正确诱饵片段的重组子转入酵母细胞株YM4271中，通过严格的3-AT抑制试验获得酵母单杂交宿主细胞，为筛库做准备。 5.文库筛选筛选人肝脏的cDNA酵母杂交文库，通过营养缺陷培养和3-AT加压的方法，收获启动报告基因表达的初筛阳性克隆；抽提酵母初筛阳性克隆的质粒，转化大肠杆菌后获得单一文库质粒，将纯化的单一文库质粒再次转入酵母单杂交宿主细胞，在酵母体内一对一验证激活报告基因的作用，获得复筛阳性克隆；复筛为阳性的克隆质粒转入LacZ报告酵母，以colony-lift-filter-assay筛选LacZ阳性克隆，得到双阳性克隆。 6.测序分析对双阳性克隆cDNA测序，并对结果进行同源性分析。 主要研究结果： 1.LPC通过诱导ABCA1表达促进巨噬泡沫细胞中的胆固醇外流体外培养的NIH小鼠腹腔巨噬泡沫细胞中加入不同浓度的LPC(10，20，40，80μM)培养，引起细胞胆固醇外流增加，上述各剂量的LPC均可以增加ABCA1mRNA和蛋白的表达(P＜0.01)，在10-80μM的剂量范围内呈剂量依赖关系。 在体外培养的小鼠腹腔巨噬泡沫细胞中加入40μMLPC培养不同的时间(0，12，24h，48h)，随着LPC与细胞作用时间的延长，胆固醇外流增加(P＜0.01)，ABCA1mRNA和蛋白的表达亦显著增加(P＜0.01)，在12-48h内呈明显的时间依赖关系。 小鼠泡沫细胞预先与400μM的DIDS(ABCA1抑制剂)作用12h、24h后，再与40μMLPC作用24h，DIDS预处理降低了ABCA1mRNA和蛋白的表达，LPC诱导的胆固醇外流受到显著抑制(P＜0.01)。 2.LPC通过上调LXRα的表达来诱导ABCA1介导胆固醇外流用不同浓度的LPC(10，20，40，80μM)与小鼠腹腔巨噬泡沫细胞共孵育，引起胆固醇外流增加，各剂量的LPC在增加ABCA1mRNA和蛋白表达的同时，LXRα的mRNA和蛋白的表达也增加(P＜0.01)，在10-80μM的剂量范围内呈剂量依赖关系。 40μMLPC与泡沫细胞作用不同的时间(0，12，24、48h)，随着作用时间的延长，胆固醇外流增加(P＜0.01)，LXRαmRNA和蛋白的表达同样显著增加(P＜0.01)，在12-48h内呈时间依赖关系。 细胞经10mMGGPP(LXRα的抑制剂)孵育12h、24h后，再与40μMLPC作用24h，结果表明GGPP不仅阻断LXRα的表达，并导致ABCA1mRNA和蛋白的表达减少(P＜0.01)和显著抑制LPC诱导的胆固醇外流(P＜0.01)。 3.LPC通过apoE介导LXRα-ABCA1途径诱导胆固醇外流分别以40μMLPC和10μgapoAI与正常C57BL/6J小鼠巨噬泡沫细胞作用不同时间，再以同样的方式处理apoE基因缺陷小鼠(E0)的巨噬泡沫细胞。在24h和48h与正常组比较，ABCA1和LXRα的mRNA表达在LPC或apoAI组诱导的apoE基因缺陷小鼠巨噬泡沫细胞中均有所下降(p＜0.05)，但仍保持有较高的表达量(＞105copies/μgRNA)，由于apoE的缺失，LPC引起的细胞胆固醇外流显著受阻(p＜0.01)，而apoAI引起的胆固醇外流则未受到影响(p＞0.05)。LPC通过LXRα-ABCA1途径诱导胆固醇外流必须有apoE的参与。 4.诱饵质粒与报告酵母的构建成功获得了携带DR-4三串子诱饵片段的重组子；将携带正确诱饵片段的重组子转入酵母细胞株YM4271中，在60mM的3-AT压力下获得了基因组上整合有诱饵片段的酵母单杂交宿主细胞。 5.文库的筛选在人肝脏cDNA文库中，初筛获得了阳性候选克隆48个；复筛获得阳性候选克隆32个，蓝斑选择后获得4个双阳性cDNA克隆。 6.测序结果对DNA测序结果进行了初步的生物信息学分析，Blast结果发现4个序列片断分别与丝氨酸蛋白酶抑制物、金属硫蛋白、结合珠蛋白α1S、细胞色素P450的部分mRNA高度同源。 结论： 1.LPC诱导细胞内胆固醇外流，该诱导作用可被ABCA1的阻断剂DIDS抑制，表明ABCA1参与了LPC诱导的巨噬泡沫细胞胆固醇外流过程。 2.LPC增加ABCA1和LXRα的表达，LXRα的阻断剂GGPP降低LXRα和ABCA1的表达，提示LXRα可以调控ABCA1的表达，LPC通过LXRα-ABCA1途径诱导细胞胆固醇外流。 3.LPC可能通过apoE介导的LXRα-ABCA1途径促进胆固醇外流，可能的机制是：LPC通过上调LXRα、ABCA1诱导刺激apoE的分泌，apoE可作为胆固醇的接受体，接受ABCA1从细胞中移出的胆固醇。 4.通过酵母单杂交技术，筛选出4个可与ABCA1启动子上DR-4顺式元件结合的特异性蛋白cDNA克隆，其中细胞色素P450较引人注目。结果提示：在人肝脏中可能存在着不同于LXR核受体的其他转录因子作用于DR-4顺式元件，有可能对ABCA1基因的转录起调控作用。