种子大小是直接决定产量的关键要素。揭示种子大小调控的遗传分子机制对于提高种子产量具有重要的理论和应用价值。种子的大小主要由胚珠、胚和胚乳共同决定。尽管已经鉴定到多个通过母体组织调控种子大小的关键因子,但相关的信号通路仍然需要进一步深入研究。本研究鉴定到编码拟南芥B3结构域转录因子的MEE45基因,发现该基因通过调节母体组织胚珠的发育最终调控种子的大小。主要研究结果如下:(1)MEE45通过母体组织调控种子的大小我们发现mee45突变体种子的千粒重及长宽均明显小于野生型的种子,而MEE45过表达能够回补突变体种子变小的表型,并且在野生型中过表达MEE45导致种子显著变大。进一步观察发现,与野生型相比,突变体种子的胚变小、胚的子叶细胞数目也明显减少,说明MEE45基因的突变限制了胚胎发育过程中细胞的增殖,最终导致种子变小。进行了mee45突变体和野生型的正反交实验。以mee45作母本、野生型做父本进行杂交,得到的杂合体种子表现出mee45纯合突变体种子变小的表型。而将野生型作母本、mee45突变体做父本进行杂交,得到的种子的表型则与野生型种子无明显差异。表明MEE45基因是通过母体组织调控种子大小的关键基因。(2)MEE45调控母体组织胚珠的发育分析MEE45的表达模式发现,该基因在母体组织珠被、雌配子体及受精后的合子胚中均有表达。观察胚珠的发育,发现mee45突变体珠被的起始与野生型相比明显延迟。尽管突变体的珠被最终能正常地将珠心包裹,完成胚珠的形态建成,但外珠被周长变短,珠被细胞数目减少,形成明显变小的胚珠。(3)MEE45通过维持珠被中ANT基因的表达而调控种子的大小ANT基因已被报道能够通过促进母体组织珠被的细胞增殖来调控种子大小。在mee45突变体的种子中,ANT基因的转录水平明显下降;而在过表达MEE45的种子中,ANT基因的转录水平显著上升。通过分析野生型与mee45突变体中ANT基因的表达模式,发现在mee45突变体的成熟胚珠珠被中ANT的表达明显减弱。ChIP-qPCR和EMSA实验证实MEE45直接结合于ANT基因的启动子上的CATGCA(-623bp/-628bp)位点。此外,我们利用突变了MEE45结合位点的ANT启动子驱动YFP报告基因,验证该结合位点对于ANT启动子活性的影响,结果显示与未进行突变的ANT启动子相比,突变后的启动子活性明显减弱。表明MEE45结合ANT启动子是启动转录所必需的。为了验证MEE45与ANT在调控胚珠发育和种子大小的遗传学关系,我们鉴定了ANT基因的弱突变体ant-T。通过杂交获得mee45 ant-T双突变体,观察发现双突变体的种子大小和重量都与ant-T单突变体类似,其种子大小则比mee45突变体明显减小。同时,过表达ANT能够将mee45种子变小的表型恢复到与野生型相似,且ant-T突变体抑制了高表达MEE45种子变大的表型。说明ANT作为MEE45的直接靶基因,与MEE45作用于同一遗传途径调控种子的大小。(4)MEE45-ANT途径作用于珠被中YUC基因介导的生长素合成通过转录组数据分析,发现多个与生长素的生物合成相关的基因在mee45突变体中显著下调,包括YUC1、YUC2、YUC4、YUC5和YUC10等。我们用pYUC4::YUC4-GFP分析了YUC4基因在野生型、mee45突变体和MEE45过表达胚珠中的表达模式。结果显示,在mee45突变体的珠被中YUC4的表达明显减弱;而在MEE45过表达的珠被中,YUC4的表达明显增强。表明MEE45与胚珠中YUC介导的生长素的生物合成密切相关。进一步研究发现,ant-T突变体中YUC基因的表达水平相比野生型明显降低,而在35S::ANT转基因植株的种子中,YUC基因表达水平明显升高。上述结果表明,YUC基因在胚珠中的表达需要ANT。ChIP-qPCR分析发现,ANT能够结合到YUC4基因的启动子上直接作用于YUC4基因的表达,说明MEE45通过其靶蛋白ANT直接作用于YUC介导的生长素合成。(5)珠被中生长素的生物合成是MEE45调控种子大小所必需的生长素(IAA)的含量检测结果证实,突变体生长素含量与野生型相比明显降低。细菌生长素合成酶基因iaaM的过表达能够使mee45突变体的种子大小增加到野生型的水平。在mee45突变体中用珠被特异性启动子INO启动YUC4在珠被中异位过表达,发mee45突变体能够恢复到野生型的表型,证实珠被中生长素调节胚珠发育和种子大小。本研究初步揭示了MEE45调控种子大小发育的分子遗传机制。MEE45通过调控胚珠的大小最终决定种子的大小。MEE45-ANT遗传途径通过维持珠被中生长素的合成,进而维持胚珠发育和种子大小。研究结果为揭示母体组织调控种子发育的机理提供了重要信息。