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第一部分糖代谢对原发性干燥综合征B细胞功能影响的研究背景和目的原发性干燥综合征（Primary Sj（?）gren’ssyndrome,pSS）以高免疫球蛋白血症和外分泌腺受累为主要特征的系统性自身免疫病。临床主要表现为唾液腺及泪腺组织受累引起的口干、眼干、猖獗性龋齿和腮腺炎等。长期以来,临床及机制研究表明B细胞的异常,可导致pSS出现自我反应性自身抗体的出现,并贯穿疾病始终,因此,B细胞被认为是pSS发病的关键细胞。细胞代谢是细胞存活周期中一个不可缺少的生化过程,它提供了非常基本的能量和物质。近年研究认为,免疫细胞的代谢异常可能在自身免疫性疾病的发展中起着关键作用。由于B细胞在pSS发病、发展过程中发挥了重要作用,而目前pSS外周血B细胞的代谢情况尚无报道。因此,本研究重点关注pSS患者B细胞糖代谢是否存在异常,抑制B细胞糖酵解和氧化呼吸通路是否会影响B细胞的活化、增殖、分化、类别转化及B细胞分泌抗体的能力。材料和方法本研究共入组pSS患者35例,纳入年龄、性别匹配的健康对照者43例。分离外周血单个核细胞（PBMC）并利用磁珠分选法分选出外周血B细胞,应用Seahorse XF24的糖酵解压力测试模块和线粒体压力测试模块,检测B细胞的糖酵解和氧化磷酸化水平。应用流式细胞术检测糖酵解抑制剂和氧化磷酸化抑制剂对B细胞的活化、增殖及分化的影响;应用qPCR技术检测抑制代谢通路后B细胞向浆细胞分化时基因变化。并对既往B细胞高通量测序数据进行再分析。结果1.可溶性CD40配体（sCD40L）+白介素（Interleukin-4,IL-4）+胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）的寡脱氧核苷酸（ODN）刺激方案下,pSS外周血B细胞较健康对照拥有更高的最大糖酵解能力和最大呼吸能力;2.sCD40L+IL-4+CpG 方案培养（加/不加 2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-arabino-hexose,2-DG）（2mM）处理）,B细胞活化相关因子CD80平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）显著降低（2485.57±626.11 vs.3001.00±798.53,P=0.03）,B 细胞活化相关因子 CD86MFI 显著降低（4653.43±1305.40 vs.7103.00±2259.41,P<0.001）;sCD40L+IL-4+Anti-IgM 方案培养（加/不加 2-DG（2mM）处理）,B 细胞活化相关因子 CD80MFI 显著降低（1586.14±249.89 vs.1845.43±259.24,P=0.002）,B细胞活化相关因子 CD86MFI 显著降低（3960.71±1221.45 vs.6736.57±2680.82,P<0.001）;3.采用sCD40L+IL-4+CpG培养方案对外周血B细胞进行培养,随着2-DG浓度的增加,无论是在SS组还是HC组,外周血B细胞的增殖均可被2-DG显著抑制,差异具有统计学意义（2-DG=1mM,P=0.014;2-DG=2 mM,P=0.017）;4.采用 sCD40L+IL-4+CpG 方案培养,结果表明 CD19+IgD+CD38+/-Naive B细胞在2-DG（2mM）的干预下比例出现升高（80.58%±6.28%vs.72.82%±9.19%P=0.029）,CD 19+IgD-CD38-memory B 细胞比例下降（2.12%±1.21%vs.4.51%±0.35%,P=0.013）,CD19+IgD-CD38hi 浆母细胞比例下降（0.6%±0.18%vs.1.19%±0.16%,P=0.004）,差异具有统计学意义;采用sCD40L+IL-4+Anti-IgM方案培养,结果表明CD19+IgD+CD38+/-Naive B细胞在2-DG（2mM）的干预下比例出现升高（83.30%±5.38%vs.79.35%±5.77%P=0.019）,CD19+IgD-CD38-memory B 细胞比例下降（3.50%±0.57%vs.4.52%±0.69%,P=0.026）,CD19+IgD-CD38hi 浆母细胞比例下降（0.28%±0.06%vs.0.52%±0.11%,P=0.049）;5.采用sCD40L+IL-4+CpG方案培养,使用2-DG（2mM）或二甲双胍（10mM）处理后,PAX5mRNA 表达显著下降（2-DG:0.12±0.02 vs.0.37±0.17,P=0.02;Met:0.08±0.06 vs.0.37±0.17,P=0.03）,而对IRF4及XBP1 的影响不显著。采用 sCD40L+IL-4+CpG 方案培养,当 2-DG=2mM 时,PAX5 mRNA 的表达量（0.079±0.017 vs.0.147±0.019,P<0.001）及 IRF4 mRNA 的表达量（0.093±0.005 vs 0.20±0.036,P=0.044）显著下降;使用二甲双胍干预时,PAX mRNA（Met=5mM:0.106±0.036 vs.0.147±0.020,P=0.002;Met=10mM:0.047±0.029vs.0.147±0.020,P=0.004）表达量及 XBP1 mRNA表达（0.085±0.040 vs.0.543±0.207,P=0.012）显著减少;6.sCD40L+IL-4+CpG 培养方案下,2-DG（2-DG=2mM:43.23±10.59（ng/mL）vs64.78±13.32（ng/mL）,P=0.003;2-DG=1mM:51.11±6.48（ng/mL）vs.64.78±13.32（ng/mL）,P=0.028）和二甲双胍（Met=10mM:50.60±29.68（ng/mL）vs.77.46±28.64（ng/mL）,P<0.001;Met=5mM:61.46±35.58（ng/mL）vs.77.46±28.64（ng/mL）,P=0.016）均可明显抑制B细胞分泌IgG的能力;pSS外周血B细胞分泌的IgM可受到 2-DG（2-DG=2mM:5.14±2.05（ng/mL）vs.12.70±4.74（ng/mL）,P<0.001;2-DG=1mM:7.53±4.54（ng/mL）vs.12.70±4.74（ng/mL）,P=0.013）和二甲双胍（Met=10mM:10.25±2.51（ng/mL）vs.16.722±4.10（ng/mL）,P=0.02）的抑制;pSS外周血B细胞分泌的IgA可受到2-DG抑制（2-DG=2mM:5.77±1.89 vs.9.16±3.37,P=0.031;2-DG=1mM:7.21±2.14vs.9.16±3.37,P=0.039）,差异具有统计学意义。7.挖掘既往pSS外周血B细胞高通量测序数据,其中部分差异基因可富集于代谢相关通路,包括糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢。结论pSS外周血B细胞拥有更高的糖酵解能力和呼吸能力,使用代谢通路抑制剂可在一定程度上抑制B细胞功能,包括B细胞的活化、增殖、分化及抗体分泌。代谢可能参与pSS外周血B细胞功能的维持。第二部分 原发性干燥综合征外周血单核细胞DNA甲基化分析背景和目的近年来随着机制研究的深入,固有免疫系统在原发性干燥综合征（Primary Sj（?）gren’ssyndrome,pSS）中的作用备受关注,越来越多的证据指出固有免疫在pSS早期阶段和维持促炎的重要性。单核/巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分,研究认为,单核/巨噬细胞功能的紊乱会造成自身免疫的发生,单核/巨噬细胞反映了pSS患者的炎症状态,可能与pSS的发病密切相关。越来越多的证据表明表观遗传对自身免疫性疾病的发病机制有贡献。既往研究表明,T细胞、B细胞DNA甲基化模式的改变是pSS发生发展的一个重要特征。我们对来自pSS和对照受试者的外周血单核细胞（Monocyte）进行DNA甲基化研究,从多个角度分析pSS外周血单核细胞DNA甲基化的特征。材料和方法本实验入组北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的pSS患者1 1例,并收集年龄、性别相匹配的健康人5例。应用磁珠分选法对外周血CD14+单核细胞进行阳选,应用Illumina850K甲基化芯片对单核细胞存在的DNA甲基化位点进行检测。通过对比分析,筛选出pSS和健康对照者之间的差异DNA甲基化位点（DMPs）,利用GO注释和KEGG pathway对DMPs所注释的基因进行富集,分析DMPs注释基因可能存在的生物学功能。结果1.通过对11例pSS患者和5例健康对照者外周血单核细胞进行DNA甲基化芯片检测,通过比对,共筛选到2819个DMPs（1977个低甲基化位点和842个高甲基化位点）;2.在2819个DMPs中筛选到25个满足|Δβ|>0.6且P<0.05的DMPs,注释到17个基因上,其中IFI44L、MX1、PARP9、EPSTI1、IFITM1与IFN信号通路相关,分析pSS和HC中这些基因的变化模式,我们发现这些DMP在pSS中均为低甲基化表现;3.pSS患者和健康对照者之间共检测到1193个DMR,存在于1053个基因上,最显著的DMR位于6号染色体（adjustP=2.98E-37）,与TNXB对应。TNXB位于6号染色体,属于腱生蛋白家族,与细胞黏附相关;4.GO分析注释发现DMPs注释基因涉及的生物过程主要包括细胞黏附、抗原提呈、I型干扰素通路;进行KEGG pathway分析发现DMPs注释基因富集在钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、抗原提呈、细胞黏附及病毒感染等通路。5.将外周血单核细胞的DMPs与来自公开数据库唾液腺上皮细胞（SEGC）、T淋巴细胞、B淋巴细胞的DNA甲基化数据进行比较,单核细胞与唾液腺上皮细胞有21个相同DMPs,与T淋巴细胞之间有11个共同DMPs,与B细胞之间有85个相同DMPs。共同低甲基化DMPs所注释的基因多与IFN信号通路相关;6.分析抗SSA抗体+并且抗SSB抗体+的pSS患者与健康对照者之间的差异,对DMPs注释的差异基因进行分析,发现主要富集于细胞黏附、抗原提呈以及病毒感染等相关通路,而抗SSA抗体+并且抗SSB抗体-的pSS患者与健康对照者之间DMPs明显少于抗SSA抗体+并且抗SSB抗体+的pSS患者;7.分析高IgGpSS患者（IgG≥18g/L）与非高IgGpSS患者（IgG<18g/L）外周血单核细胞的DNA甲基化模式,共筛选到89个DMPs,包括21个高甲基化的DMPs,注释68个低甲基化的DMPs,KEGG Pathway分析,发现差异DMPs注释到的基因主要富集到Notch信号通路、丙酮酸代谢及氨基酸代谢相关通路。结论pSS单核细胞中存在异常的DNA甲基化,强调了固有免疫及表观遗传DNA甲基化的异常在pSS发病机制中的潜在作用,并表明IFN相关基因以及单核细胞黏附、Notch信号通路、抗病毒和抗原加工/呈递相关的基因在外周血单核细胞中存在异常DNA甲基化状态。