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水飞蓟宾是一种黄酮木脂素类化合物,是治疗肝病和保肝护肝药物水飞蓟素的主要活性成分。目前市场上的水飞蓟宾为水飞蓟植物的提取物。由于受到季节、气候和品种等的影响和限制,存在产量有限和质量不稳定等诸多问题。利用生物转化或合成生物学方法生产水飞蓟宾,可以有效解决这些问题。目前,水飞蓟宾的原生合成途径尚未完全解析,成为微生物合成水飞蓟宾的主要障碍。因此,本论文对水飞蓟宾原生合成途径的关键未知节点进行了解析。通过强化反应体系中过氧化氢酶活性,解决了香草醇氧化酶在合成松柏醇过程中的反馈抑制和产物过度氧化问题。基于黄杉素途径的特点及解脂亚洛酵母作为底盘的优势,对黄杉素合成途径进行了模块化,并在解脂亚洛酵母进行了构建、验证和优化。通过自主调控解脂亚洛酵母中脂肪酸合成,提高了黄杉素合成效率。最后,本研究构建了水飞蓟宾高效合成的方法。本论文不仅为微生物合成水飞蓟宾及其前体化合物作出了基础性的工作,其中的水飞蓟宾和松柏醇转化方法也具有很强的应用价值。本论文的主要研究内容如下:（1）解析了水飞蓟宾的原生合成途径。对水飞蓟不同组织中水飞蓟宾及其前体含量进行分析,发现其分布的差异性;通过转录组测序发现,水飞蓟具有典型的黄酮类化合物和苯丙素类化合物合成途径,相关基因在不同组织器官中的表达存在差异性;体外仿生研究表明,过氧化物酶和漆酶可以实现水飞蓟宾的催化合成;通过转录组数据分析、基因异源表达、过氧化物酶活性分析及水飞蓟宾合成能力分析,确定种皮中催化水飞蓟宾合成的为抗坏血酸过氧化物酶APX1;最后,提出了水飞蓟宾的原生合成途径及前体的运输机制。（2）构建了高效的松柏醇转化体系。针对松柏醇原生合成途径在微生物中重构可能存在转化率低的问题,提出了一种由PsVAO和过氧化氢酶组成的酶级联转化方法,可以将丁香酚转化为松柏醇,同时,通过原位清除其中的H2O2解除对PsVAO的反馈抑制并减少产物的过度氧化。对不同来源和种类的过氧化氢酶进行分析,筛选了3种具有较高过氧化氢酶活性和低过氧化物酶活性的酶,并将其引入松柏醇合成反应体系中;通过转化条件优化及补加丁香酚,在1.5 L反应规模下,合成了22.9 g?L-1松柏醇,转化率和生产强度分别为78.7%和0.5 g?L-1?h-1;最后,对产物进行了分离纯化鉴定。（3）构建了以解脂亚洛酵母解脂亚洛酵母为底盘的黄杉素合成菌株。根据黄酮类化合物在微生物中合成普遍遇到的问题,及解脂亚洛酵母的特点,提出以解脂亚洛酵母为底盘构建黄杉素合成途径;根据黄杉素合成途径的限速因素,对黄杉素合成途径进行了模块化构建、验证和优化;并通过增加限速步骤基因拷贝数对合成途径进行优化;通过强化分支酸途径和丙二酰辅酶A途径,强化了胞内前体供给,提高了黄杉素合成效率;对发酵条件进行优化,发现较高的葡萄糖浓度和添加浅蓝菌素能够提高黄杉素的产量;最后,在分批补料发酵中黄杉素的产量达到99.8 mg?L-1。（4）构建了基于CRISPRi的黄杉素前体供给的动态调控方法,提高了黄杉素合成效率。构建了解脂亚洛酵母随机整合和定点整合方法,并对整合效率进行了验证;对一系列启动子的脂肪酸诱导强度及动态范围进行了分析,选择嵌合启动子（A1R1）x2A3用于脂肪酸动态调控;设计并分析了不同gRNA对脂肪酸合成关键基因转录的阻遏效率,及其对调控脂肪酸积累和黄杉素合成的影响;对不同基因进行了多基因组合阻遏分析,并研究了对脂肪酸积累和黄杉素合成的影响;关键基因转录阻遏导致脂肪酸积累减少,黄杉素合成增加,且关键基因转录水平与脂肪酸积累正相关,与和黄杉素合成负相关,表明所设计的基于CRISPRi的脂肪酸动态调控方法发挥了预期的效果;对脂肪酸合成动态调控下的发酵参数进行检测,证明了脂肪酸合成动态调控对提高黄杉素合成的效果。（5）构建了高效的水飞蓟宾合成方法。为了建立高效的水飞蓟宾合成方法,对不同来源和种类的过氧化物酶进行分析,发现催化水飞蓟宾合成的能力与过氧化物酶的来源和种类无关;建立了以香草醇氧化酶PsVAO和水飞蓟过氧化物酶APX1组成的酶级联体系,可将丁香酚和黄杉素转化为水飞蓟宾和异水飞蓟宾,同时不产生任何有害代谢副产物;对反应条件进行优化,获得了最优的pH、温度、底物比例,及溶氧条件对反应的影响;在1.5 L规模进行验证,12 h内合成了2.58 g?L-1水飞蓟宾和异水飞蓟宾,黄杉素转化率为76.7%。