干扰素(Interferon,IFN)是机体抗病毒感染的第一道免疫屏障,应用领域已逐步发展到抗病毒、抗肿瘤等方面。犬干扰素α(Canine Interferon alpha,CaIFNα)是犬类动物在受到外界特定刺激后,免疫细胞分泌的细胞因子之一,具有广谱抗病毒、加强免疫应答反应、弱抗原性等一系列特点。CaIFNα的抗病毒作用主要与干扰素刺激基因产物(Interferon Stimuluated Genes,ISGs)有关,ISGs通过抑制病毒核酸的转录翻译及蛋白合成从而发挥抗病毒作用。但是由于CaIFNα半衰期短等原因限制了 CaIFNα在临床中的应用。蓖麻毒素(Ricin toxin,RT)为一种高毒性的植物蛋白,主要存在于蓖麻籽中,由A链和B链组成,两条链通过二硫键连接,其中RTA是毒性链,RTB是运载体,具有凝集素作用,与哺乳细胞膜表面甘露糖受体结合,运输RTA亚基进入细胞内部发挥毒性。课题组前期研究发现重组RTB可作为免疫增强剂,增强机体细胞免疫应答及体液免疫应答。并且可巨噬细胞增加JAK1、TYK2、STAT1等细胞因子磷酸化水平。本研究采用基因重组表达技术,将CaIFNα和RTB进行融合表达,制备一种新型干扰素融合表达蛋白,该蛋白性质稳定,并且在体内、体外试验中均能长效发挥抗病毒作用,优化剂型制成的纳米制剂,能显著提高融合表达蛋白稳定性。具体研究内容分以下四个方面:1.犬干扰素α/RTB的原核表达研究通过重叠PCR技术分别将CaIFNα、(G4S)3Linker、RTB进行连接,克隆至大肠杆菌表达载体pET28a中,获得含有rCaIFNα/RTB编码序列的重组质粒pET28a-CaIFNα/RTB,转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中,确定工程菌BL21/pET28a-CaIFNα/RTB 诱导表达条件为:IPTG 浓度 0.8 mmol/L,37℃,诱导8 h。rCaIFNα/RTB融合表达蛋白主要以包涵体形式表达。对变性后rCaIFNα/RTB蛋白进行离子交换层析、金属鳌合亲和层析后对其进行复性,最终得到具有活性的rCaIFNα/RTB融合表达蛋白。2.犬干扰素α/RTB的体外抗病毒活性研究通过MDCK-VSV方法检测犬干扰素α/RTB抗病毒活性,发现其抗病毒比活为1.04×109IU/mg,证明将CaIFNα与RTB融合表达后并未影响CaIFNα抗病毒活性。实验证实犬干扰素α/RTB无法抑制WISH细胞中VSV复制,表明rCaIFNα/RTB具有种属特异性。3.犬干扰素α/RTB犬体内药代动力学研究及抗犬细小病毒研究犬干扰素α/RTB药物代谢动力学研究显示,犬干扰素α/RTB经单次肌肉注射给药后,与rCaIFNα相比较,药物半衰期(t1/2)为49.65 h,半衰期增加9.5倍。药物达峰时间缩短,并且rCaIFNα/RTB在犬体内生物利用率增加。犬干扰素α/RTB在抗犬细小病毒试验中,预防率为100%,可有效降低致死率。经血常规分析对比,均显示出犬干扰素α/RTB具有较好的抗犬细小病毒作用。4.犬干扰素α/RTB纳米化剂型及其抗病毒活性研究利用高分子化合物PEI10000对该蛋白药物进行纳米化,表征试验证实rCaIFNα/RTB@PEI10000纳米颗粒药物具有纳米级尺寸(～300 nm),体外MDCK-VSV方法检测其抗病毒活性,且纳米化过程中未发生蛋白药物抗病毒活性降低。研究证实rCaIFNα/RTB@PEI10000纳米颗粒具有pH及温度耐受性,可在极酸性条件:pH 2.0,透析4 h,65℃高温孵育4 h后仍具有显著抗病毒活性。本项研究为犬干扰素α的生物学修饰提供了新的思路和发展方向,并且对生物毒素亚基可作为一种载体蛋白提供了有力证据。通过重组犬干扰素α//RTB新剂型研究,证实PEI10000高分子化合物作为一种简单有效的纳米药物载体,在药物稳定性研究中具有较大应用潜力。