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相对于嗜温微生物的常温发酵工艺,在工业生产中使用嗜热微生物进行高温发酵生产,具有提高生化反应速率、降低染菌风险、减少发酵冷却能耗等潜在优势。热葡糖苷酶地芽孢杆菌的最适生长温度为60℃,生长代时16分钟,并且能够充分利用木质纤维素水解物,因此是高温微生物发酵的优秀底盘候选菌株。热葡糖苷酶地芽孢杆菌作为生产菌株能够将其耐高温、生长快速、利用廉价碳源等特性,与工业生产中减少冷却水的使用、降低染菌风险、缩短发酵周期和降低发酵原辅料成本等多种需求相互契合,具有极大地开发价值。本论文利用耐热绿色荧光蛋白作为反筛标记,开发了一种快速便捷的地芽孢杆菌遗传操作方法。使用该方法对热葡糖苷酶地芽孢杆菌进行代谢工程改造,实现了产量从无到有,从低到高的高温核黄素生产菌株的开发。在热葡糖苷酶地芽孢杆菌中引入异源核黄素生物合成基因簇,获得第一代核黄素菌株Rib-Gtd,核黄素产量达28.7 mg/L;对ribCGtg进行点突变,获得降低核黄素细胞消耗的第二代核黄素菌株Rib-Gtdl,核黄素产量达84.6mg/L;敲除嘌吟途径的调控蛋白PurRGtg解除对嘌呤途径的抑制,获得第三代核黄素菌株Rib-Gtd2,核黄素产量达110.7mg/L;为了避免嘌呤合成途径的代谢流流向腺嘌呤,进一步敲除了 purAGtg增加前体供应获得第四代核黄素菌株Rib-Gtd3,核黄素产量达171.6 mg/L;敲除ccpNGtg调节中心碳代谢到核黄素的生产获得第五代核黄素菌株Rib-Gtd4,核黄素产量达260±15 mg/L;敲除乳酸脱氢酶基因ldhGtg阻断副产物乳酸的生成获得第六代核黄素菌株Rib-Gtd5,核黄素产量达445.8mg/L。最后,工程化的菌株在葡萄糖-木糖混合物作为碳源的矿物盐培养基中发酵12-h核黄素产量达1034.5 mg/L。本研究通过对热葡糖苷酶地芽孢杆菌进行一系列代谢工程改造,实现核黄素在嗜热菌中的高温发酵生产。该研究表明热葡糖苷酶地芽孢杆菌有望克服常温工艺的天然缺陷,突破目前常温发酵生产核黄素面临的诸多限制因素,成为工业生产中核黄素高温发酵的高产宿主,具有继续深入改造的潜力以及提高我国核黄素产业市场竞争力的前景。