论文部分内容阅读
背景:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以对称性多关节炎为主要临床表现的系统性、自身免疫性疾病。目前,RA病因病机尚不十分清楚,西医对RA治疗无特效方法,仅为对症治疗,且毒副作用大,而RA中医属“痹症”范畴,《临证指南医案》指出:“痹者,闭而不通之谓也,正气为邪所阻,脏腑经络不能畅达,皆由气血亏损,腠理疏豁,风寒湿三气得以乘虚外袭,留滞于内以致湿痰,浊血流注凝涩而得之。”艾灸作为中医外治法一种,能够温经通络,活血化瘀从而治疗痹症,具有整体性、简便快捷、副作用小等多种优势。艾灸虽然为治疗RA的一种常用的中医外治法,但其作用机制不明确。本导师课题组前期开展过基于蛋白组学及血清代谢组学的艾灸治疗RA大鼠的研究,研究结果表明蛋白质及血清代谢物存在变化。研究结果为进一步探讨艾灸治疗RA的作用机制奠定基础。与蛋白组学相比,代谢组学具有能够对代谢产物进行高通量分析以及将蛋白层面微小变化在代谢物上放大,更容易检测等独特优势。代谢组学最常用的样本是血液和尿液,而与血液样本比,尿液样本具有生物组成更加稳定、提取步骤相对简单等优势,同时由于代谢组学的高通量性和大规模性,致使单一血清样本不能满足研究需求,而血液代谢组学数据与尿液代谢组学数据可以相互补充,相互验证。因此本研究采用尿液代谢组学技术从整体角度分析艾灸治疗胶原诱导型关节炎大鼠作用机制。目的:采用代谢组学气相色谱质谱(GC-MS)技术,以期从整体角度探讨艾灸干预胶原诱导型关节炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)大鼠尿液代谢谱的变化,探讨其作用机制。方法:选用SPF级雄性SD大鼠24只,将其按照随机数字表法分为对照组、模型组、艾灸组,每组8只,模型组与艾灸组全都进行CIA大鼠造模。造模成功后,艾灸组进行艾灸双侧“肾俞”、“足三里”穴,每日1次,每个穴位1Omin,连续6天为1个疗程,共灸3个疗程,疗程间休息1天;对照组和模型组不予艾灸治疗,但以同法同时间固定大鼠。为评价RA大鼠发病情况和艾灸治疗RA疗效,分别于分别于造模前、造模成功后(即艾灸前)、艾灸3周对大鼠一般情况进行观察;于造模前、艾灸前、艾灸1周、2周、3周对大鼠体重、左右足趾容积平均值进行测量;于艾灸前、艾灸1周、2周、3周对关节炎指数评分(Arthritis Index,AI)进行测量;于艾灸3周结束后对组织病理学结果进行分析。分别采集艾灸1周、2周、3周后各组大鼠尿液样本,运用GC-MS分析技术,探究RA不同疗程尿液代谢谱变化情况及艾灸的干预效果。结果:(1)一般情况:造模前,3组大鼠一般情况良好;艾灸前,对照组大鼠一般情况良好,模型组和艾灸组大鼠均出现皮毛色泽度降低,关节红肿;艾灸3周后,对照组无异常表现,模型组大鼠饮食、活动与皮毛色泽均无改变,关节红肿明显,艾灸组大鼠关节红肿明显改善,与模型组相比更加活跃。(2)体重:造模前,3组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05),基线具有可比性;艾灸前,与对照组相比,模型组与艾灸组大鼠体重减轻,且差异有统计学意义(P<0.05),;艾灸干预1周、2周,与对照组相比,模型组和艾灸组大鼠体重仍有统计学意义(P<0.05),但艾灸组体重有逐渐恢复趋势;艾灸干预3周,与对照组相比,模型组大鼠体重仍有统计学意义(P<0.05),但艾灸组大鼠体重无统计学意义(P>0.05)。(3)足趾容积:造模前,3组大鼠左右足趾容积平均值无统计学差异(P>0.05),基线具有可比性;艾灸前和艾灸1周,与对照组相比,模型组和艾灸组大鼠足趾容积明显增加,且具有统计学意义(P<0.05),而模型组与艾灸组大鼠之间足趾容积无统计学意义(P>0.05);艾灸干预2周、3周,与对照组相比,模型组和艾灸组大鼠足趾容积具有统计学意义,而模型组与艾灸组大鼠之间足趾容积相比也有统计学意义(P<0.05),但艾灸组大鼠足趾容积明显恢复。(4)AI评分:艾灸前,模型组和艾灸组大鼠AI评分均高于4分,模型组和艾灸组差异无统计学意义(P>0.05),提示基线具有可比性;艾灸干预1周,模型组和艾灸组大鼠AI评分差异无统计学意义(P>0.05),但艾灸组AI评分明显小于模型组;艾灸2周、3周,艾灸组和模型组大鼠相比AI评分显著下降(P<0.01)。(5)组织病理学:3组大鼠踝关节HE染色可见:对照组大鼠踝关节无明显异常;模型组大鼠出现关节腔狭窄、严重的充血水肿、以及大量的炎细胞浸润和组织坏死。艾灸组大鼠关节滑膜炎症减轻,关节囊腔较为光滑,结构层次较为清晰,有轻度充血水肿。(6)尿液代谢组学分析:基于GC-MS的尿液代谢组学描述了类风湿关节炎不同干预时期的尿液代谢物调控情况。艾灸干预1周后,模型组与对照组相比,Nicotinic acid、Pyruvate、Hippuric acid、Xanthine、Palmitic acid、Stearic acid、Oleic acid、Glycolic acid、2-methylhippuric acid、L-Valine、urinary adenine、5-hydrosy-6-methoxyindole glucuronide、Spermidine浓度上升,且差异具有统计学意义(P<0.05);L-Phenylalanine、Xanthurenic acid浓度下降,且差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比,艾灸治疗后,这15个代谢物水平虽无统计学意义,但均有一定的回调。艾灸干预2周后,模型组与对照组比,Malonic acid、Succinate、Indole sulfate、L-Glutamine、p-cresol 浓 度 上 升,5-Hydroxyindoleacetic acid、4-Hydroxybenzaldehyde、Vanillylmandelic acid、Kynurenic acid、Phenylalanine、Uric acid浓度下降(P<0.05);艾灸组Kynurenic acid、L-Phenylalanine、Uric acid、Malonic acid、Succinate、L-Glutamine浓度和模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),浓度明显回调,其余代谢物水平虽无统计学意义,但均有一定的回调。艾灸干预3周后,模型组与对照组比,Malonic acid、p-cresol sulfate、L-Alanine、3-methyldioxyindole、P-cresol glucuronide、Oxoglutaric acid浓度上升,Citric acid、dihydroxyquinoline、3-hydroxyanthranilic acid、L-Phenylalanine浓度下降(P<0.05);艾灸组Citric acid、L-Phenylalanine、p-cresol sulfate、3-methyldioxyindole、Oxoglutaric acid浓度和模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),浓度明显回调,其余代谢物水平虽无统计学意义,但均有一定的回调。(7)代谢通路:通过对差异代谢物分析,艾灸治疗RA大鼠的作用机制,主要涉及调控糖酵解/糖异生和TCA循环、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢、丁酸代谢等代谢通路。结论:(1)艾灸干预3周可以明显改善CIA大鼠一般情况、体重、足趾肿胀和AI评分,亦可以使关节滑膜炎症减轻,结构层次较为清晰,表明艾灸具有改善关节炎的作用。(2)艾灸改善关节炎的作用机制与对糖酵解/糖异生和TCA循环、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢、丁酸代谢等代谢通路的调控作用有关。