目的:肌腱细胞体外扩增过程易导致其表型丧失,而文献报道体外高密度培养肌腱细胞可以维持其细胞表型,本研究探索高密度培养是否可以诱导真皮成纤维细胞向肌腱细胞转分化。方法:本实验分为两组,高密度实验组为每个10 cm培养皿接种2.5×106个细胞,低密度对照组为每个10 cm培养皿接种0.36×106个细胞。扩增细胞每隔4天传代,总共传4代。培养过程中分别于第4、8和16天三个时间点收集两组细胞样本进行相关检测,以比较两组的成肌腱转分化能力,并研究其潜在机制。结果:qPCR分析发现,在第4天的时候,与低密度培养相比较,高密度培养能使真皮成纤维细胞表达更高的tenomodulin（TNMD）,collagen type Ⅲ（COL3）,decorin和tenascin-c。在第8天的时候,与低密度培养相比较,高密度培养能使真皮成纤维细胞表达更高的scleraxis（SCX）,TNMD,COL1,COL3,COL6,decorin和tenascin-c。在第16天的时候,高密度培养能使真皮成纤维细胞表达更高的 SCX,TNMD,COL1,COL3,COL6,decorin 和 tenascin-c。在第 4 天和第8天时间点,高密度培养不能诱导真皮成纤维细胞向成骨、成软骨和成脂分化。而且高密度培养既不能使软骨细胞表达更高的COL2,aggrecan和SOX9,也不能诱导其成肌腱分化。此外,高密度培养可以使真皮成纤维细胞的（transforming growth factor-β1）TGFβ1 和 growth differentiation factor（GDF）5、6、7 和 8 的基因表达上调,同时也促进TGFβ1和GDF8的分泌增加。显微镜观察到在高密度组中,细胞拥有更加狭长的形态。加入细胞骨架破坏剂Cytochalasin D,可以破坏高密度组中的细胞形态,并且下调SCX和TNMD的基因表达。加入TGF-β信号阻断剂（LY2109761）或者BMP和GDF8信号阻断剂（LDN193189）,也能下调高密度培养所诱导的SCX和TNMD的基因表达。结论:本研究证实高密度培养可诱导真皮成纤维细胞表达肌腱细胞的表型分子,而无法诱导其他表型分子的表达。该诱导机制可能主要通过细胞形态改变及促肌腱形成因子间的协同调控。目的:以往拓扑结构对细胞功能影响主要集中在诱导干细胞的分化,很少研究拓扑结构对终末分化细胞向另外一种成熟细胞转分化的作用。本研究旨在探索刻纹硅胶膜诱导的狭长细胞形态能否促使真皮成纤维细胞向肌腱细胞表型转分化。方法:本实验分为两组,实验组是将细胞种在10 宽,3 深的沟槽当中,诱使细胞呈狭长形态;对照组将细胞接种于光滑培养皿上,使细胞呈铺张状态。分别在两种细胞膜上培养4天或12天,并在基因水平和蛋白学水平,比较两组成肌腱分化能力的差异。在此基础上进一步探索成纤维细胞转分化的相关机制。结果:培养在刻纹膜上的成纤维细胞呈狭长形态,而在光滑膜上的细胞却呈铺展态。qPCR分析发现,刻纹硅胶膜上的真皮成纤维细胞比对照组表达更强的肌腱相关基因如 scleraxis,tenomodulin,collagens Ⅰ,Ⅲ,Ⅵ和 decorin 等。Western Blot进一步证实刻纹硅胶膜可以促进真皮成纤维细胞表达更高的tenomodulin和collagen Ⅵ。蛋白组学分析也证实了刻纹硅胶膜可以在蛋白水平促进真皮成纤维细胞表达更高的 collagen ⅠA1,ⅠA2,collagen ⅢA1,collagen ⅥA1,ⅥA3和decorin等。同时刻纹硅胶膜不能使真皮成纤维细胞向其他细胞类型分化,狭长形态和铺展态的细胞的成软骨、成脂肪、成神经和成肌相关的标记物基因表达水平是相似的,并且刻纹膜上的细胞的成骨基因OCN和ALPL表达更低的。相反,刻纹硅胶膜培养软骨细胞可导致其表型的破坏,但是狭长形态的软骨细胞并不能向肌腱细胞转分化。狭长形态能诱导真皮成纤维细胞高表达TGF-β1,而加入低剂量外源性重组TGF-β1（2ng/ml）能进一步加强狭长形态真皮成纤维细胞表达更高的scleraxis和tenomodulin,并减少α-SMA的基因表达。而高剂量（10ng/ml）TGF-β1却减少狭长真皮成纤维细胞所表达的scleraxis和tenomodulin,反而促进α-SMA的基因表达。相关机制研究证实了狭长形态能减少RhoA活性和增强ROCK活性。TGF-β中和抗体或TGF-β受体阻断剂、ROCK抑制剂或者骨架解聚剂cytoclasin D处理细胞均可显著抑制狭长形态诱导的真皮成纤维细胞向肌腱细胞表型转分化。结论:本研究结果证实刻纹硅胶膜可诱导真皮成纤维细胞成狭长形态并表达肌腱细胞的表型,有利于其向肌腱细胞转分化。其涉及的可能机制包括狭长形态导致的相关信号（包括细胞骨架信号）与TGF-β间协同调控。目的:由于纳米材料能较好地模拟细胞微环境的优点,已经被广泛的应用于组织再生。已有报道平行排列的的纳米纤维材料可以诱导干细胞向肌腱细胞分化,但是此种特殊拓部结构材料能否诱导成熟的真皮成纤维细胞转分化为肌腱细胞仍未探索,本研究主要探索平行排列纳米静电纺丝材料诱导真皮成纤维细胞向肌腱细胞转分化的作用和该拓扑结构是否有利于组织内源性细胞迁移入支架材料中并促进组织工程化肌腱形成的作用。方法:首先应用静电纺丝技术纺出平行有序和杂乱无序的材料,而后将真皮成纤维细胞以密度为1.5×103/cm2接种在纳米电纺丝材料表面,在不同的时间点观察两种材料上细胞的排列,并且通过qPCR技术检测肌腱相关标志物基因的表达。为模拟肌腱三维环境,将两种材料分别蜷曲并固定在不锈钢丝架上,然后接种细胞,分别在体外培养6周和12周,观察不同拓扑结构三维纳米材料对真皮成纤维细胞体外肌腱形成能力的作用;另外将接种细胞的材料复合物移植于裸鼠背部,观察体内三维纳米材料对真皮成纤维细胞成肌腱能力的影响。此外,将未接种细胞的纳米电纺丝纤维支架材料被移植于大鼠跟腱缺损处,观察平行排列的纳米材料能否招募宿主局部成纤维细胞进入支架材料和再生肌腱组织。结果:接种在电纺的平行纳米纤维材料上的真皮成纤维细胞呈狭长细胞形态并且qPCR分析证实在静电纺丝材料表面上,平行排列纳米纤维能促进真皮成纤维细胞成肌腱相关基因表达的上调,如SCX,MKX,TNMD,COL1,COL6,Tenascin-c,BGN和FMOD。扫面电镜也印证了平行材料对细胞狭长形态的诱导作用及促进细胞外基质分泌的作用。在体外三维组织构建6周和12周后,平行排列纳米纤维能促进真皮成纤维细胞所有肌腱相关的分子基因的表达,并且还能形成平行有序的组织结构。在裸鼠体内模型当中,平行排列的纳米纤维较无序纳米纤维能更好形成类肌腱样组织结构。在大鼠肌腱缺损模型中,移植12周后,两种单纯纳米材料都能修复大鼠肌腱,但有序平行排列纳米纤维对肌腱的修复作用明显好于无序纳米纤维,形成了更加成熟的肌腱样组织结构,并加速支架材料的降解。结论:平行排列纳米纤维能诱导真皮成纤维细胞向肌腱细胞转分化,并且有利于招募内源性成纤维细胞参与肌腱组织的修复和再生。平行纳米材料复合活性因子可能是肌腱形成的良好材料。目的:前期实验我们已经使用自体成纤维细胞作为种子细胞在体内和体外构建组织工程化肌腱。而采用异体细胞构建组织肌腱也已有报道,且可形成预先构建的组织工程肌腱移植,随时用于临床治疗。此外,也有报道显示单纯材料也可以修复组织,然而异体细胞和单纯材料构建肌腱的效果是否类似于自体细胞仍然有待于阐明。本实验利用兔跟腱修复作为动物模型,对自体细胞、同种异体细胞复合支架材料及单纯支架材料再生肌腱和缺损修复的效果进行比较研究。方法:新西兰大白兔项部获得真皮组织,分离自体真皮成纤维细胞并在体外扩增5代后接种在组织工程肌腱复合支架材料上（内部是纵行排列的无纺棉PGA,外部是由4:2的PGA和PLA构成外网套）作为自体组。同样,从绿色荧光蛋白（GFP）转基因兔获得真皮细胞体外扩增后接种支架材料作为异体组。无细胞的支架材料作为单纯材料组。所有接种细胞的材料和单纯材料均用2%（20 mg/ml）交联的透明质酸外裹后,放于培养箱2小时后,再行兔子肌腱缺损修复。在术后7月和13月,处死动物获取组织样本分别进行大体观察、组织学、透射电镜及力学检测等分析。结果:术后7月样本的大体观在三组之间没有显著差异,但在材料降解速率上有一定的差异;术后13月样本大体观三组见亦无显著差异,总体而言,其组织成熟度要好于7月时间点的组织样本,且材料降解程度更大。两个时间点的组织样本力学分析显示三组之间的力学性能没有统计学差异（p>0.05）。组织学结构在三组之间也没有显著差异。TEM分析显示在术后7月,自体组胶原原纤维直径要大于材料组（p<0.05）,而在术后13月时,自体组胶原原纤维直径要大于材料组和异体组（p<0.05）,材料组和异体组胶原原纤维直径无显著差异。结论:研究结果证实成纤维细胞确实可以作为种子细胞构建肌腱。自体和异体细胞及单纯材料三组修复肌腱的效果没有显著差异,但再生肌腱组织学结构,支架材料降级速率及成功率存在一定的差异。目的:前期实验我们利用兔跟腱部分横断修复作为模型发现单纯复合材料外裹透明质酸也有可能形成良好的肌腱样组织。而部分横断模型中,仍有部分跟腱保持连接,故植入的支架材料所接受的力学刺激信号有限,无法观察模拟正常生理状态下全力学负荷刺激信号对跟腱再生的作用。为此,本研究采用兔跟腱全横断模型观察在全负荷力学刺激信号下单纯支架材料是否也能形成肌腱样组织,并同时观察透明质酸复合支架材料是否能更好地促进单纯材料再生肌腱组织。方法:复合材料制备如第四章所述,单纯复合材料复合透明质酸组是指在无纺棉材料内加入0.5%非交联的透明质酸胶而网套材料外裹2%的交联的透明质酸胶。本实验分四组,将单纯复合材料植入兔子背部皮下不予以力学刺激作为皮下材料组;将单纯复合材料植入兔跟腱缺损部位并给予力学刺激作为跟腱材料组;将单纯复合材料与透明质酸复合放入兔子背部皮下不予以力学刺激作为皮下材料透明质酸组;将单纯复合材料与透明质酸复合植入兔跟腱缺损部位并给予力学刺激作为跟腱材料透明质酸组。分别在术后3个月和6个月取材,进行大体观、组织学、力学和透射电镜及基因水平检测观察全负荷力学刺激对单纯材料再生肌腱的作用。结果:实验结果发现在两个时间点中,跟腱受力组形成的组织结构更加接近于正常组织,明显要好于背部不受力组;并且力学强度也要强于背部不受力组（p<0.05）,肌腱相关基因 tenomodulin,collagens Ⅰ,Ⅲ,Ⅵ,tenascin-c,decorin 和fibromodulin表达也要高于背部不受力组（p<0.05）。在3个月时候,跟腱单纯材料透明质酸组力学强度要好于跟腱单纯材料组（p<0.05）,随着时间延长到6个月时候,两者力学强度无显著差异（p>0.05）。在3个月时候,通过HE及透射电镜观察发现在组织结构上,跟腱单纯材料透明质酸组要好于跟腱单纯材料组,胶原原纤维直径要大于跟腱单纯材料组（p>0.05）但到6个月时候两者间组织结构和胶原胶原直径无明显差异（p>0.05）。结论:在跟腱完全离断下,单纯材料在全负荷力学刺激下的体内环境中能形成较好的肌腱样组织。单纯材料经过透明质酸修饰在早期就能较快地招募内源性细胞参与组织的修复;随着时间延长及细胞逐步浸入、分泌和沉积细胞外基质,不经修饰的单纯材料组也能在力学刺激下较好再生肌腱组织。