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条斑紫菜作为一种大型经济海藻,由于其基因组较小,成为藻类遗传和发育研究的模式生物。细菌人工染色体文库是基因克隆及基因组学研究的一个重要工具,在基因组的物理图谱构建、序列测定、基因的图位克隆等研究中发挥着重要的作用。因此构建一个高质量的紫菜大片段基因组文库对海藻的基因组学研究很有必要。在本实验中,我们构建了条斑紫菜的BAC文库并对其进行了鉴定和筛选。该文库包含54144个克隆,平均插入片断大小为65kb,空克隆率小于0.7%。由于紫菜的基因组大小为2.7-5.3×108碱基对,本文库对基因组的覆盖率达到至少在6.6倍以上。相关的测试结果已显示了此文库具有很好的真实性和稳定性。同时用PCR方法筛选了紫菜的BAC文库,海藻糖合成酶基因的引物在10、22和42号板池DNA中扩增出目的带,即成功筛选到含海藻糖合成酶基因的三个阳性克隆池。上述结果表明此BAC文库可以用于紫菜的基因克隆和基因组学研究。
海藻糖(α-D-glucopyranosyl-[1,1]-α-D-glucopyranose)是一种广泛存在于自然界中的非还原性双糖,由两个分子葡萄糖构成。研究表明它的存在能使生物体提高抵抗温度、pH等变化的能力;并且在干旱条件下,它还能够稳定细胞内的生物结构,所以海藻糖可作为一种很有前景的食品稳定剂,药品添加剂和植物抗逆的保护剂。本研究中我们用RACE-PCR的方法从条斑紫菜中克隆了海藻糖合成酶基因PyTPS,获得了其全长cDNA序列(3221bp),217-2940区域为基因的开放阅读框(ORF),编码的蛋白质大小为908aa。将对应的蛋白质序列PyTPS与水稻、拟南芥、酵母和大肠杆菌的海藻糖合成酶进行聚类分析得知,同源关系分别为:40%、39%、32%和27%。同时还构建了原核表达载体pET22b-PyTPS,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达。