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目的：1.构建携带大鼠Suv39h1基因的重组腺病毒载体(Ad-Suv39h1),观察其对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs) Suv39h1的过表达效应；2.构建携带大鼠Suv39h1基因RNA干扰序列的重组慢病毒载体(LV-Suv39h1shRNA),观察其对VSMCs的Suv39h1表达沉默效应；3.探讨过表达或沉默Suv39h1,对血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ, AngⅡ)和高糖(high glucose, HG)诱导的VSMCs增殖和迁移的作用及其分子机制；4.探讨过表达或沉默Suv39h1,对糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生和内皮化的影响及其机制。方法：1.经鉴定构建成功的穿梭质粒pDC316-Suv39h1,与骨架质粒共转染293细胞,同源重组获得Ad-Suv39h1。经扩增、纯化、PCR鉴定后,测定获得的重组腺病毒载体滴度。重组腺病毒按感染复数(multiplicity of infection, MOI)0,10,15,20,25,30转染VSMCs,流式细胞仪检测感染效率。以最佳MOI值转染对数生长期的VSMCs, Western blot检测Suv39h1蛋白表达。2.根据Suv39h1的mRNA序列,设计4条Suv39h1siRNA靶点序列,并体外合成含shRNA的DNA序列。将含shRNA的DNA片段与线性化的载体GV118连接、转化后,PCR筛选阳性克隆子并测序鉴定。经鉴定构建成功的GV118-Suv39h1shRNA和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集重组慢病毒颗粒,并采用荧光法测定滴度。取构建成功的4种LV-Suv39h1shRNA,转染VSMCs, Real-time PCR检测Suv39h1mRNA表达,筛选出Suv39h1敲减效果最佳的LV-Suv39h1shRNA作后期实验用。3.组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMCs,3-5代为实验用细胞。0.2μg/ml Ang Ⅱ刺激VSMCs后,Western blot检测Suv39h1和ID3表达；5mmol/L (NG)或30mmol/L葡萄糖(HG)刺激VSMCs后,检测Suv39h1和补体C3蛋白水平。Ad-Suv39h1和LV-Suv39h1shRNA,以及相应的对照病毒转染VSMCs, Ang Ⅱ刺激后Tanswell小室法评估VSMCs迁移,Western blot检测Suv39h1、ID3、p21、 p27KIP1和PCNA的表达；HG刺激后检测VSMCs迁移,Suv39h1、补体C3、p-p38、 p-ERK1/2和PCNA蛋白水平。4.雄性SD大鼠高脂饲料喂养4w,40mg/kg链脲佐菌素(streptozocin, STZ)腹腔注射诱导DM大鼠模型。所有实验动物随机分为6组：正常生理盐水(normal saline, Nor-NS)、DM-NS、DM-Ad-Suv39h1、DM-Ad-Null、DM-LV-Suv39hl shRNA和DM-LV-NC shRNA组,建立颈动脉球囊损伤模型。损伤血管局部转染相应病毒,NS组给予同体积NS。 DNA芯片分析损伤血管基因改变；Real-time PCR检测Suv39h1补体C3和ID3mRNA水平；组织形态学染色评估血管内膜增生情况；免疫组织化学染色评价血管壁增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和CD31的表达。结果：1.PCR扩增凝胶电泳结果显示,重组腺病毒载体Ad-Suv39h1构建成功。流式细胞仪检测显示,包装后的腺病毒载体在VSMCs的最佳感染复数为MOI=15。Ad-Suv39h1转染VSMCs72h后,Suv39h1蛋白表达较Ad-Null组增加近1倍(p<0.05)。2.PCR扩增及测序结果显示,重组GV118-Suv39hl shRNA载体构建成功。包装后的4种重组慢病毒载体LV-Suv39h1shRNA (KD1、KD2、KD3和KD4),荧光法测定其滴度均在108-109TU/ml, MOI=40时VSMCs感染效率可达85%。转染VSMCs96h后,与NC组相比,KD2组Suv39h1mRNA敲减效率为52%,KD3和KD4组均达60%以上,KD1组则达到80%以上(均为p<0.05)。3. Suv39h1基因沉默可显著抑制Ang Ⅱ诱导的VSMCs迁移和增殖。与Ad-Null组相比,Ang Ⅱ刺激1h, LV-Suv39h1shRNA转染VSMCs诱导Suv39h1和ID3表达下降,p21和p27KIP1明显增加(均为p<0.05)。下调Suv39h1,还可拮抗HG诱导的VSMCs迁移和增殖。与LV-NC shRNA组相比,HG刺激16h, LV-Suv39h1shRNA组Suv39h1表达和补体C3的含量下降,p-ERK1/2水平显著受抑(均为p<0.05),p-p38水平降低(p>0.05)。4.术后7d损伤血管行DNA芯片分析显示,与相应的对照组比较,过表达Suv39h1后,233个基因表达上调,221个基因表达下调；下调Suv39h1后,849个基因表达上调,658个基因表达下调(相对含量>1.5倍,p<0.05)。DM组较正常对照组,损伤血管的Suv39h1mRNA下降,补体C3和ID3mRNA水平明显上升(均为p<0.05)。DM大鼠Suv39h1基因沉默后,随着Suv39h1水平的敲减,补体C3和ID3水平较LV-NC shRNA组也明显下降(均为p<0.05)。术后28d,与DM-LV-NC shRNA组相比,DM-LV-Suv39h1shRNA组内膜增生减少,新生内膜PCNA阳性细胞率下降,内皮CD31阳性覆盖率增加(均为p<0.05)。结论：1.成功构建携带Suv39h1基因腺病毒表达载体,对体外培养的大鼠VSMCs Suv39h1有明显的过表达效应。2.成功构建Suv39h1基因RNAi慢病毒表达载体,对体外培养的大鼠VSMCs Suv39h1有显著的沉默效应。3. Suv39h1基因沉默可抑制AngⅡ或HG诱导的VSMCs增殖和迁移。其分子机制可能是通过下调ID3和补体C3的表达,导致细胞周期抑制蛋白p21和p27KIPl表达增加,ERK1/2磷酸化活化受抑。4. Suv39h1基因沉默能抑制DM大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜形成,其机制可能与调控细胞增殖、迁移、分化和DNA复制等生物学效应的多个基因下调,补体C3和ID3的水平下降有关。5. Suv39h1基因沉默可促进DM大鼠血管损伤后的内皮化修复,其机制可能与补体C3水平下降有关。