【摘 要】
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9α-羟基-4-雄烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）可用于皮质类激素等甾体药物的合成,是一种重要的甾体药物中间体,而利用化学方法合成具有反应时间长,污染环境且产量较低的缺点。甾体类化合物微生物转化过程特异性强,转化周期短,产物回收率高,具有广阔的开发和应用前景。研究以3-酮类固醇9α-羟化酶KSH（由加氧酶Ksh A和铁氧还蛋白还原酶Ksh B组成）催化底物4-雄甾烯-3,17-二酮（4-AD
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9α-羟基-4-雄烯-3,17-二酮（9α-OH-AD）可用于皮质类激素等甾体药物的合成,是一种重要的甾体药物中间体,而利用化学方法合成具有反应时间长,污染环境且产量较低的缺点。甾体类化合物微生物转化过程特异性强,转化周期短,产物回收率高,具有广阔的开发和应用前景。研究以3-酮类固醇9α-羟化酶KSH（由加氧酶Ksh A和铁氧还蛋白还原酶Ksh B组成）催化底物4-雄甾烯-3,17-二酮（4-AD）生产9α-OH-AD的反应体系为研究对象,在已有研究表明Ksh B是反应体系中限速酶的基础上,筛选到了一种自给自足P450酶来源的还原酶PRF,并对催化反应过程中重要的[2Fe-2S]簇构效关系进行分析,提出了一种新型电子传递路径。最后将高效催化反应体系引入大肠杆菌构建工程菌株进行甾体生物转化应用。研究通过截短三种铁氧还蛋白还原酶（Ksh B,TDO,PRF）中的铁氧还蛋白（Fdx）结构域表明[2Fe-2S]簇在电子转移过程中不可或缺的作用。同时对两种类型[2Fe-2S]簇的电子传递效率进行阐明。基于定点诱变还原酶中[2Fe-2S]簇以实现两种类型[2Fe-2S]簇相互转化的实验数据,发现植物型[2Fe-2S]簇较Rieske型普遍具有更显著的电子传递效率。将Ksh B、TDO和PRF中C末端的[2Fe-2S]簇结合域分别添加到N末端以构建含有双[2Fe-2S]簇的融合蛋白,结果均显著提高了底物转化率,同时表明了植物型[2Fe-2S]簇在电子传递过程中具有更高的协助作用。之后通过序列比对和挖掘,将筛选到的游离Fdx添加到体外多酶催化反应体系中,结果与未添加游离Fdx相比均显著提高了底物转化率。进一步选取催化效率最高的多酶催化反应体系（PRF+Dm Fdx2+Ksh A）进行了蛋白质-蛋白质相互作用分析,结果显示游离Fdx似乎为电子从还原酶到加氧酶创造了一个新的电子通道。并通过GST Pull-down实验、ITC测定、氧化还原电势测定以及基于电子分叉理论分析验证了这种新型电子转移路径的合理性和高效性。最后将高效催化体系引入大肠杆菌构建工程菌株BLA-PD（Ksh A+PRF+Dm Fdx2-BL21）,全细胞催化数据显示了最终9α-OH-AD的产率为95.4%,表明了具有高活性还原酶和有效电子转移载体对于甾体转化的重要性,以及BLA-PD在工业上高效生产9α-OH-AD的潜力。
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