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目的：1.诱导及建立稳定耐低浓度阿霉素的骨肉瘤MG-63细胞株,为进一步研究骨肉瘤化疗耐药的发生机制以及后期基因靶点治疗提供细胞来源。2.在稳定耐阿霉素的骨肉瘤MG-63细胞株中,了解阿霉素和PD98059对MEK/ERK1/2通路及MMP2的影响。3.设计并构建针对MMP2的siRNA,并利用siRNA技术转染耐药骨肉瘤细胞株确定转染条件,对转染效率进行检测并检测MMP2沉默后ERK1/2激活表达。方法：1.采用脉冲式逐步增加阿霉素浓度技术选择并培养耐低浓度阿霉素的骨肉瘤细胞,本次骨肉瘤系为人骨肉瘤MG-63细胞株。实验组为阿霉素诱导后稳定耐阿霉素100ng/ml和200ng/ml细胞组,对照组为非诱导骨肉瘤MG-63株。MTT, transwell,流式细胞仪,AnnexinV/PI双染法对细胞增殖、体外侵袭性、细胞周期、凋亡进行鉴定。2.实验组为阿霉素诱导后稳定耐阿霉素100ng/ml和200ng/ml细胞组,对照组为非诱导骨肉瘤MG-63株。RT-PCR和western blot技术对三组细胞PD98059阻断ERK通路前后的ERK1/2和MMP2的mRNA及蛋白进行检测。3.骨肉瘤系为耐阿霉素200ng/m1人骨肉瘤MG-63细胞株。设计并构建化学合成三条siRNA (1、2、3),显红色荧光siRNA在不同转染时间点和转染浓度后检测荧光显色结果。并在同一条件下检测siRNA1、siRNA2、siRNA3转染后MMP2的蛋白表达量；根据确定的实验条件和选定的siRNA进行转染,上述为实验组,对照组设为沉默B-actin的阳性对照组,无意序列的阴性对照组及空白组。沉默MMP2后western blot检测,主要了解p-ERK1/2蛋白表达的改变。结果：1.耐低浓度阿霉素细胞株最终可以在4个月的诱导后稳定生长、传代。与非耐药骨肉瘤株相比,实验组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率明显减低(p<0.05)；增殖力减慢；体外侵袭性高于对照组(p<0.05)。2.耐阿霉素骨肉瘤细胞株,随着耐药浓度的增加,p-ERK1/2与非耐药骨肉瘤株相比呈正相关(p<0.05)；MMP2在阿霉素浓度上升至200ng/ml时才有明显差异(p<0.05)。PD98059随着浓度增加,阻断ERK通路的同时也降低了p-ERK1/2和MMP2的表达,在浓度达到及超过20μmol/L时,差异明显(p<0.05)。3. siRNA成功转染进入耐阿霉素骨肉瘤细胞株。24~48小时中,转染效率逐渐增加,转染48小时后,转染效率为82%(p<0.05),在72小时后,转染效率降低至58%,有统计学差异(p<0.05)。选择最终siRNA实验浓度为50nM,转染后检测时间为48小时,通过RT-PCR和western blot技术检测三条siRNA在上述条件下的MMP2沉默效果,结果设计的第二条siRNA,即siRNA2的沉默效果最好(p<0.05)。检测siRNA2转染后,在成功沉默MMP2的同时,磷酸化ERK1/2的表达增加,且随着沉默效果的增加呈明显正相关(p<0.05)。结论：1.运用脉冲式逐步增加阿霉素浓度培养技术,可以成功诱导耐低浓度阿霉素骨肉瘤MG-63细胞株,为临床化疗产生耐药提供了用于体外研究的耐药细胞株,奠定了针对耐药可能应用的基因靶向治疗的基础。2.骨肉瘤细胞MG-63稳定耐阿霉素后,MEK/ERK通路进一步激活MMP2的表达,参与了细胞耐药的信号通路机制。ERK1/2可能直接参与了MMP2的表达调控。3.骨肉瘤细胞MG-63稳定耐阿霉素后,化学合成小干扰RNA可以成功转染进入细胞内部,并与MMP2的mRNA结合,在短时间内沉默MMP2的表达,并导致RRK1/2的激活,表明除了ERK通路管理下游MMP2的表达,还存在MMP2对ERK的负反馈环的存在。