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研究背景及目的：血管内皮细胞功能障碍是多种血管性疾病的关键环节，硒蛋白S（Selenoprotein S，SelS）具有抗氧化能力，对内皮细胞具有保护的作用。迄今为止，关于血管细胞粘附分子-1（Vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1）单抗-微泡声学造影剂（Microbubble contrast agent，MCA）-目的基因-超声照射（Ultrasound exposure，UE）联合应用于靶向药物或基因治疗的相关研究尚未见报道。本研究拟构建pcDNA3.1-SelS真核表达载体，通过多级抗生物素蛋白-生物素桥接化学法制备与VCAM-1单抗相连接携带目的基因SelS的微泡声学造影剂复合体（SelS gene-containing Microbubble contrast agent linked with the Monoclonalantibody against VCAM-1，SMMV），评价该超声微泡与配体的结合，为靶向转染奠定物质和技术基础，并探讨SMMV介导基因转染大鼠胸主动脉的效率，为寻求基因治疗血管性疾病的有效途径提供实验基础。方法：1.质粒的准备：将pcDNA3.1-SelS质粒通过感受态大肠杆菌进行转化、扩增、无内毒素质粒提取试剂盒大量提取，经XhoI和EcoRI酶切后凝胶电泳及测序鉴定。2. SMMV的制备：通过多级抗生物素蛋白-生物素桥接化学法连接MCA和VCAM-1单克隆抗体形成MCA-VCAM-1单抗复合体（Microbubble contrast agentlinked with the Monoclonal antibody against VCAM-1，MMV），然后MMV和pcDNA3.1-SelS混合制成SMMV备用。3.微泡鉴定方式：①采用血细胞计数仪测定微泡浓度；②普通光镜下观察微泡的形态，大小，分布及稳定性；③荧光标记的二抗与MMV混合，避光，冰上孵育，荧光显微镜下观察微泡的荧光标记情况。4.2型糖尿病大鼠模型的建立及分组：健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只持续高糖高脂饲料喂养，4周后予腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）30mg/kg建立2型糖尿病（Type2diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，T2DM成模后予维生素D3腹腔注射（总量60万U/kg，分3次每隔1周注射1次）；共喂养16周后，成模的40只T2DM大鼠随机分为空白对照组（C组，n=8），超声+微泡组（UE+MB组，n=8），单纯pcDNA3.1-SelS组（SelS组，n=8），SMMV组（SMMV组，n=8），超声+SMMV组（UE+SMMV组，n=8）。5. SMMV的体内转染鉴定：SMMV尾静脉注射，注射结束30s后，应用基因转染治疗仪超声照射大鼠心前区（辐照能量2.06W/㎝2，连续脉冲，时间为180sec）。转染结束72h后，处死大鼠，取胸主动脉应用Real-time PCR方法检测SelS mRNA的表达；Western blot方法检测SelS蛋白的表达。结果：1.质粒的扩增：经XhoI和EcoRI酶切及测序鉴定证实pcDNA3.1-SelS真核表达载体质粒扩增成功。采用紫外分光光度计测定质粒浓度约为600~1100ng/μl。2.微泡浓度的测定：普通微泡制备后测定其浓度约为8.0×109个/ml；MMV制备后测定其浓度约为9.5×108个/ml。3.微泡的外观及镜下观察：普通微泡与MMV在外观上均呈乳白色混悬液，静置后也均可见微泡浮于液面之上。普通光镜下观察，普通微泡与MMV相比，形态、大小、分布均无显著性差异。4.微泡的稳定性：将普通微泡和MMV室温下放置24h镜下观察形态仍完整、规则。普通微泡室温下放置24h左右，镜下观察微泡的浓度降低，MMV室温放置24h左右，显微镜下只见散在的微泡，可见其稳定性比普通微泡稳定性略差。5. MMV的定性鉴定：荧光显微镜下观察，普通微泡表现为无荧光，MMV的外壳发出明亮的绿色荧光。6.大鼠胸主动脉SelS的mRNA的表达情况：Real-time PCR结果显示，UE+SMMV组SelS的mRNA的表达明显增强，高于其他4组（P＜0.05）；SMMV组SelS的mRNA的表达高于C组、UE+MB组、SelS组（P＜0.05）；C组、UE+MB组间和C组、SelS组间SelS的mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。7.大鼠胸主动脉SelS的蛋白的表达情况：Western blot结果显示，UE+SMMV组SelS的蛋白的表达明显增强，高于其他4组（P＜0.05）；SMMV组SelS的蛋白的表达高于C组、UE+MB组、SelS组（P＜0.05）；C组、UE+MB组间和C组、SelS组间SelS的蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：1.通过多级抗生物素蛋白-生物素桥接化学法成功制备了SMMV，为靶向转染奠定物质和技术基础。2. SMMV在UE的作用下可明显增强pcDNA3.1-SelS转染入大鼠胸主动脉的效率，为血管内皮细胞保护研究及基因治疗血管病变奠定了实验技术基础。