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研究背景:急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是临床最常见的心血管急危重症,也是心源性猝死的最主要原因之一。尽管再灌注治疗心肌梗死具有一定的疗效,但由于心肌细胞的不可再生性,大面积心肌细胞坏死后继发缺血性心肌病,导致心脏扩大与心功能下降,最终发展为心力衰竭。因此,寻求一种更为有效的治疗方法成为研究学者的重要任务。近年来,干细胞移植治疗急性心肌梗死获得了广泛的基础研究,其中骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）移植治疗心肌梗死颇受青睐。但由于心肌梗死后缺血缺氧的微环境,致使移植的BMSCs存活率以及滞留率受到了极大的限制。前期研究表明,基因修饰可提高细胞的存活率及生物学功能。核因子相关因子-2（Nuclear factor-erythroid 2-Reated Factor 2,Nrf2）是机体抗氧化反应的最重要调节因子之一,氧化应激状态下可激活下游多种抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录和表达,如血红素氧化酶-1（Heme Oxygenase-1,OH-1）等。本实验拟在氧化应激状态下在BMSCs中过表达Nrf2的水平,试图提高心肌梗死后缺血缺氧环境下移植BMSCs的存活率,进而提高移植细胞的生物学功能。新生血管的形成对心肌梗死后心功能恢复至关重要。血管生成是由现有的血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells,VECs）生成新的血管,涉及内皮细胞的激活,增殖和迁移等,其中心肌微血管内皮细胞（Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs）与心肌血管生成密切相关。本研究拟利用在过氧化氢（Hydrogen Peroxide,H2O2）诱导BMSCs凋亡的基础上,观察在BMSCs中过表达Nrf2基因,与CMECs建立体外共培养模式,模拟细胞内微环境,探讨共培养体系下BMSCs通过旁分泌作用对CMECs血管新生能力的影响,为干细胞的治疗提供新的治疗靶向与策略。第一部分Nrf2/HO-1/NQO1轴在过表达Nrf2基因的BMSCs凋亡中的作用以及机制目的:（1）培养实验所需的BMSCs并选取P3代BMSCs加以其表面分子的鉴定并构建大鼠慢病毒载体Nrf2基因过表达以及沉默转染稳定细胞株;（2）观察在300μmol/L H2O2处理BMSCs 4h诱导BMSCs凋亡的氧化应激基础上,过表达Nrf2基因对BMSCs增殖和凋亡的影响;（3）氧化应激状态下,探讨Nrf2/HO-1/NQO1信号通路在氧化应激状态下抑制BMSCs凋亡的影响。方法:（1）采用全骨髓贴壁法培养实验所需的BMSCs并采用流式细胞术（FCM）检测BMSCs表面标记抗原（CD90和CD45）;（2）分别使用倒置荧光显微镜、qRT-PCR以及Western Blot法检测慢病毒转染Nrf2基因至P3代BMSCs成功;（3）经H2O2建立BMSCs氧化应激模型:采用FCM检测不同浓度H2O2（0、100、200、300、400μmol/L）处理4h对BMSCs的影响,选取最佳的H2O2浓度作为诱导BMSCs最佳的凋亡模型,作为后续实验的处理条件。实验分为5组,分别为:空白对照组（Control组）、Nrf2沉默空载体组（Nrf2-Vector组）、Nrf2沉默组（si-Nrf2组）、Nrf2过表达空载体组（Nrf2-Scramble组）、Nrf2过表达组（LV-Nrf2组）;（4）Edu以及流式细胞周期检测各组BMSCs的增殖能力;（5）Tunel以及FCM检测各组BMSCs的凋亡情况;（6）Western Blot检测各组BMSCs中抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1及NQO1的表达水平。结果:（1）P0代BMSCs原代细胞培养至第3天,细胞有触角伸出,细胞形态多数呈多角形、棱形,少部分呈现条索状,细胞为成簇状团状生长,胞浆内有颗粒状结构分布;培养至第7天,原代细胞长满80%90%,即可开始传代培养。传代后细胞进入快速生长期,第3代细胞形态均一,呈鱼群状。用FCM鉴定,第3代SD大鼠BMSCs CD90阳性表达（97.18%）,而CD45弱表达（3.36%）。（2）当MOI=150时,慢病毒转染BMSCs 48h后,倒置荧光显微镜下可见少量绿色荧光表达,转染72h后,绝大多数细胞呈现出绿色荧光;用qRT-PCR以及Western Blot检测:LV-Nrf2组Nrf2表达明显上调（P<0.05）;si-Nrf2组Nrf2表达明显下调（P<0.05）。（3）300μmol/L H2O2处理BMSCs 4h作为诱导BMSCs凋亡的最佳浓度和时间,用于体外模拟心肌梗死后氧化应激微环境。（4）Edu以及流式细胞周期检测结果显示:si-Nrf2组BMSCs增殖率显著下调（P<0.01）;LV-Nrf2组BMSCs的增殖率显著上调（P<0.01）。（5）Tunel以及FCM检测各组凋亡率,结果显示si-Nrf2组BMSCs总体凋亡率显著上调（P<0.01）;LV-Nrf2组BMSCs的总体凋亡率显著下调（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示:LV-Nrf2组抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1及NQO1的相对表达量显著上调（P<0.01）;si-Nrf2组抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1及NQO1的相对表达量显著下调（P<0.01）。结论:（1）利用全骨髓贴壁法可有效的培养出实验所需的、纯度较高的BMSCs。（2）当MOI=150、转染72h时,慢病毒转染BMSCs可获得稳转株细胞。（3）300μmol/L H2O2处理BMSCs 4h是诱导BMSCs凋亡的最佳浓度和时间。（4）氧化应激环境下,过表达Nrf2基因促进BMSCs增殖,抑制BMSCs凋亡。（5）氧化应激环境下,过表达Nrf2可有效增加抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1以及NQO1的表达水平。第二部分Nrf2/HO-1/NQO1轴在抑制骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡及共培养后促进心肌微血管内皮细胞（CMECs）血管新生中的作用及机制研究目的:本实验的目的在于通过采用Transwell小室体外建立BMSCs与CMECs间接共培养体系,探讨过表达Nrf2基因的BMSCs通过其旁分泌作用对CMECs生物学的影响。以单独完全培养基培养的CMECs为阴性对照组,探讨共培养方式下Nrf2基因转染的BMSCs对CMECs血管新生的影响以及探讨Nrf2/HO-1/NQO1信号通路在其中的作用。方法:实验分为6组,NC组（单独CMECs培养组）、Control-BMSCs组（未转染病毒的BMSCs与CMECs共培养组）、Nrf2-Vector-BMSCs组（转染Nrf2沉默空载体的BMSCs与CMECs共培养组）、si-Nrf2-BMSCs组（转染沉默Nrf2基因的BMSCs与CMECs共培养组）、Nrf2-Scramble-BMSCs组（转染Nrf2过表达空载体的BMSCs与CMECs共培养组）以及LV-Nrf2-BMSCs组（转染过表达Nrf2基因的BMSCs与CMECs共培养组）,利用Transwell小室（膜孔直径0.4μm）体外建立BMSCs--CMECs共培养体系。（1）分别检测各组CMECs的血管新生能力,即Transwell小室（膜孔直径8.0μm）检测CMECs的迁移能力;（2）基质胶检测CMECs的成管能力;（3）Edu以及流式细胞周期检测CMECs的增殖能力;（4）Tunel检测CMECs的凋亡情况;（5）Western Blot检测各组CMECs中抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1及NQO1的表达水平。结果:（1）Transwell小室结果显示:五组共培养体系中CMECs的迁移能力明显高于单独CMECs培养组（P<0.01）;与Control-BMSCs组相比,LV-Nrf2-BMSCs组结晶紫染色阳性的跨Transwell小室膜迁移的CMECs数量显著升高（P<0.01）;si-Nrf2-BMSCs组结晶紫染色阳性的跨Transwell小室膜迁移的CMECs数量显著降低（P<0.01）。（2）基质胶结果显示:五组共培养体系中CMECs的小管形成能力明显高于单独CMECs培养组（P<0.01）;与Control-BMSCs组相比,LV-Nrf2-BMSCs组小管形成能力显著增加（P<0.01）;si-Nrf2-BMSCs组小管形成能力显著减少（P<0.01）。（3）Edu结果显示:五组共培养体系中CMECs的Edu紫色荧光阳性细胞数比例明显高于单独CMECs培养组（P<0.01）;与Control-BMSCs组相比,LV-Nrf2-BMSCs组Edu紫色荧光阳性细胞数比例明显上调（P<0.01）;si-Nrf2-BMSCs组Edu紫色荧光阳性细胞数比例显著下调（P<0.01）。（4）细胞周期结果显示:五组共培养体系中CMECs的增殖率显著高于单独CMECs培养组（P<0.01）;与Control-BMSCs组相比,LV-Nrf2-BMSCs组CMECs增殖明显增强（P<0.01）;si-Nrf2-BMSCs组CMECs增殖率显著减弱（P<0.01）。（5）Tunel结果显示:五组共培养体系中CMECs凋亡率明显低于单独CMECs培养组（P<0.01）;与Control-BMSCs组相比,LV-Nrf2-BMSCs组CMECs凋亡率明显降低（P<0.01）;si-Nrf2-BMSCs组CMECs凋亡率显著升高（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示:五组共培养体系CMECs中抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1及NQO1的表达水平高于单独CMECs培养组（P<0.01）;与Control-BMSCs组相比,LV-Nrf2-BMSCs组CMECs中抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1及NQO1的表达水平显著上调（P<0.01）;si-Nrf2-BMSCs组CMECs中抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1及NQO1的表达水平显著下调（P<0.05）。结论:（1）CMECs免疫荧光鉴定CD31以及Ⅷ因子呈阳性表达。（2）与BMSCs共培养可以促进CMECs的增殖、迁移以及血管新生能力,降低CMECs的凋亡。（3）与未转染的BMSCs相比,Nrf2基因转染可以增强共培养对CMECs的增殖、迁移、血管新生以及抗凋亡能力的影响。（4）过表达Nrf2可有效增加抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1以及NQO1的表达水平。