研究背景随着儿童肥胖发生率的迅速增长,儿童肥胖正成为一个日趋严重的危害健康的全球性问题。伴随着生活环境的改变(如能量的过度摄入,体力活动不足,多静态活动等),肥胖患病率呈现明显上升的一个趋势。肥胖可以导致各种相关的慢性疾病,如心血管疾病,高血压,高血脂,2型糖尿病,代谢综合征以及某些肿瘤等,同时,肥胖也给家庭、社会甚至国家带来巨大的经济负担。肥胖是一种发生在多个基因、多种因素基础上的常见代谢失调症,是遗传因素和环境因素共同作用的结果。家系以及双生子研究表明,在肥胖发生过程中遗传因素占40-70%,遗传因素增加了机体对肥胖的易感性。但即便存在遗传因素的影响,肥胖的发生及发展也是包括生活方式在内的多种环境因素相互作用的结果。研究遗传因素和环境因素与儿童青少年肥胖的关联性对于肥胖的预防和控制具有极其重要的意义。近几年来,全球各研究中心的大规模的全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study, GWAS)将肥胖,代谢综合征、肿瘤以及其他重要疾病的研究推向了一个全新的高度。GWAS分析了一系列与人类肥胖相关的基因,其中肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene, FTO)是第一个由GWAS发现的与普通人群肥胖相关的可靠候选基因,在最大程度上解释了人类肥胖以及体质指数(body mass index, BMI)的变异。人类FTO基因定位于16q12.2,基因全长约400kb,包括9个外显子,全部编码蛋白质。研究表明,FTO基因普遍表达于胎儿和成人组织,在脑组织中表达最高,这是控制能量平衡的关键部位。而人类FTO基因变异可能会导致FTO基因表达的上调或者失调,携带风险等位基因者可能在不改变能量消耗的情况下通过过量摄食造成肥胖。Cecil等[3]研究了FTO基因rs9939609变异与肥胖、能量消耗和食物摄入的可能联系,发现FTO基因的变异虽然导致了肥胖的易感性却没有显示其可直接调控能量消耗,而是可能在控制食物摄取和食物选择中发挥作用,表明FTO基因与食欲过剩的表型或者喜好高能量食物有关系。目前,虽然全球,尤其在欧美人群中的研究结果多支持FTO基因与人类肥胖以及BMI的关系,但FTO基因影响肥胖的机制尚不清楚[4-6]。再者,在亚洲人群中,虽也有报道支持FTO基因与肥胖相关,但仍未得出一致的结论,尚需要更多的重复性研究来验证FTO基因在中国人群中所起的作用。研究目的本研究依托“‘十一五’国家科技支撑计划项目：代谢综合征易感人群早期筛查技术”研究的资源,以7-18岁的中国汉族儿童青少年为研究对象,旨在探讨FTO基因的单核苷酸多态性与中国汉族儿童青少年肥胖及其相关代谢指标的关系；筛查出与中国汉族儿童青少年肥胖相关的SNPs标志,以丰富和补充肥胖易感性标志,从而更全面的解释肥胖发生的遗传机制,为肥胖易感人群的识别与筛查提供科学依据。研究方法本研究依托“’十一五’国家科技支撑计划项目：代谢综合征易感人群早期筛查技术”研究的资源,以广西南宁、天津、北京、重庆以及杭州等地7-18岁的中国汉族儿童青少年为研究对象,通过病例对照研究设计来探讨FTO基因的单核苷酸多态性与中国汉族儿童青少年肥胖的关联性,筛查与中国汉族儿童青少年肥胖相关的SNPs标志。本研究的研究对象(包括病例和对照)的排除标准为：(1)患有恶性肿瘤和严重的心、肝、肾等慢性疾病史者；(2)不合作或资料不全者。病例组入选标准为：中国肥胖问题工作组(WGOC)于2003年11月公布的“中国学龄儿童青少年超重、肥胖筛查体重指数值分类标准”,即按年龄、性别分组计算得到的BMI[体重／身高2(kg/m2)].对照纳入标准为同性别、同年龄和同居住地的匹配原则。共纳入病例4000例研究对象。(Ⅰ阶段1000例,Ⅱ阶段3000例)SNP的筛选策略：(1)基因区域：FTO基因上游3000bp到下游3000bp区域；(2)人种为CHB、CHD或Asia;(3)用FastSNP和SNP Function Predication等软件进行功能预测。功能改变类型：无义突变、错义突变、同义突变、剪接调控、转录因子结合位点、增强子、microRNA位点；(4)MAF选择标准准0.15,如为错义突变、无义突变和剪接调控SNP, MAF放宽至≥0.05；(5)以r2>0.8为标准,选择TagSNP。根据前述的筛选原则,采用Haploview软件对FTO基因的连锁不平衡情况进行探索。此外,本研究还通过文献查阅对其他重要多态位点进行了补充,包括rs9939609,最终筛选出FTO基因SNPs共24个。在I阶段研究中,对1000名研究对象进行FTO基因的24个SNPs的基因分型实验,分型工作在上海天昊生物技术有限公司完成,采用SNPScan技术,其中988例分型成功；II阶段研究中,对3000名研究对象进行rs9939609多态位点的分型实验,分型工作在上海辉瑞生物科技有限公司完成,采用荧光定量PCR技术,其中2936例分型成功。应用SPSS16.0for Windows软件对各指标用1-Sample K-S进行正态性检验,在病例组与对照组之间的年龄,性别,以及其他各个研究因素的情况依据数据特征分别采用相应的统计方法：正态分布的两样本均数比较采用t检验,Χ2检验；非正态分布或方差不齐的数据用非参数秩和检验(Kruskal-Wallis, KW)等统计方法比较组间分布差异。采用Χ2拟合优度检验评价各多态基因型在对照人群中的分布特征是否符合哈代-温伯格遗传平衡定律(Hardy-Weinbergequilibrium, HWE)。采用非条件Logistic回归模型计算以年龄和性别作为调整因素的调整OR值及其95%CI,对FTO基因的24个多态基因型与儿童青少年肥胖的关联强度进行估计,多元线性回归用于研究控制年龄和性别等混杂因素后分析多态基因型与数量性状等变量间的依存关系。基因与基因之间,基因与饮食习惯之间联合作用的探索采用叉生分析,以及Logistic回归模型计算以年龄和性别作为调整因素的调整OR值及其95%CI,并作趋势分析,以上均在Plink软件中进行分析。采用Haploview软件对同一基因上的多态位点进行连锁不平衡分析,采用基于R forWindows2.14.0软件运行的Haplo.Stats1.4.4程序包模拟构建其单体型,计算以年龄和性别作为调整因素的调整OR值及其95%CI,对基因单体型与儿童青少年肥胖的关联强度进行估计。无特殊说明以检验水准P值小于0.05作为具有统计学意义。结果Ⅰ阶段研究中,在相加遗传模型下,rs7206790(P=0.018), rs9939609(P=0.002), rs11644943(P=0.023)都可能与中国汉族儿童青少年肥胖的发生相关,且经FDR调整后,rs9939609(P=0.048)具有统计学意义；在显性遗传模型下,rs9939609(OR=1.57,95%CI:1.17-2.11, P=0.002)能显著增加中国汉族儿童青少年肥胖的风险；在隐性遗传模型下,rs7206790(OR=3.76,95%CI:1.24-11.43; P=0.012), rs11644943(OR=0.16,95%CI:0.04-0.72; P=0.017)可能与中国汉族儿童青少年肥胖的发生相关。Ⅱ阶段研究中,发现rs9939609多态性位点可能显著增加汉族儿童青少年的肥胖发生风险(OR=1.57,95%CI:1.34-1.85; P<0.0001),且在加性遗传模型、显性遗传模型、以及隐性遗传模型下rs9939609均可能与中国汉族儿童青少年肥胖的发生有关(P<0.0001)。合并研究中同样发现rs9939609多态性位点能显著增加汉族儿童青少年的肥胖发生风险(OR=1.56;95%CI:1.36-1.78; P<0.0001),且在加性遗传模型、显性遗传模型、以及隐性遗传模型下rs9939609也均可能与中国汉族儿童青少年肥胖的发生有关(P<0.0001)。Ⅰ阶段研究中,进一步分析三个阳性位点与儿童青少年肥胖相关的各数量性状的影响情况。发现rs9939609的突变纯合子AA对BMI P=0.005),腰围(P=0.02),臀围(P=0.05),饮食习惯(P=0.03)等具有显著影响；rs7206790的突变纯合子GG对BMI (P=0.007),体重(P=0.005)腰围(P=0.05),臀围(P=0.01),收缩压(P=0.04)等具有显著影响；rs11644943对口味的偏好可能具有影响(P=0.02)。对其他数量性状尚未发现有统计学意义。Ⅱ阶段研究中,进一步验证发现在加性遗传模型下rs9939609的突变纯合子AA对BMI (P<0.0001),腰围(P<0.0001),臀围(P=0.0003),收缩压(P<0.0001), TG(P=0.007), LDLC (P=0.01), HDLC (P=0.0002)等具有显著影响；在显性遗传模型下,发现与野生纯合子TT相比,TA+AA对体质指数BMI (P<0.0001),体重(P=0.02),腰围(P<0.0001),臀围(P=0.0004), SBP (P<0.0001),血糖(P=0.04), TG (P=0.001), LDLC (P=0.003), HDLC (P=0.0001)等具有显著影响；在隐性遗传模型下,发现与TT+TA相比,突变纯合子AA对体质指数BMI (P=0.001),腰围(P=0.0003),臀围(P=0.005), SBP (P=0.0007), HDLC (P=0.02)等具有显著影响；对其他数量性状尚未发现有统计学意义。合并研究中的发现与I阶段和II阶段的研究结果一致。I阶段研究中,对FTO基因24个SNP单倍型分析,结果表明：单体型GG(rs4784323(G/A)-rs7206790(C/G))(OR=1.39,95%CI:1.07-1.81; P=0.02)和单体型GTA(rsl477196(G/A)-rs3751813(G/T)-rs9939609(T/A))(OR=1.65,95%CI:1.24-2.19；P=0.001)的携带者肥胖风险增加,未发现其他单体型与儿童青少年肥胖遗传易感性存在统计学关联。探索三个阳性位点与肥胖相关的生活方式包括饮食习惯、口味以及对甜食的偏好之间的交互作用发现：rs9939609与饮食习惯之间存在联合作用,OR=3.63,95%CI:1.89-7.01,且有统计学意义(P<0.001)。rs9939609与口味偏好之间也存在联合作用, OR=5.38,95%CI:2.64-10.97,且有统计学意义(P<0.001)。未发现其他交互作用存在。结论1.本研究在中国汉族儿童青少年人群中重复和验证了FTO基因的rs9939609多态位点与儿童肥胖以及BMI都存在关联。同时还发现rs9939609、rs7206790和rs11644943与体重、腰围和臀围也存在关联。今后还需要在不同人群中进行更大规模的重复研究,来验证这些关联的可靠性。将来通过对这些SNP的功能研究,来探讨遗传变异与疾病之间的因果联系,将有助于我们更深入的了解能量平衡的机制以及肥胖发生的病因。2.本研究发现FTO基因rs9939609位点多态性与肉类食物为主、偏好重口味等生活行为因素之间存在着联合作用,共同影响儿童肥胖的发生。这提示我们,对于肥胖遗传易感性的高危儿童,通过改变其不良的饮食习惯,可以降低肥胖的风险。