论文部分内容阅读
目的: 检测重症急性胰腺炎(SAP)病程中Treg/Th17平衡变化和Toll样受体4(TLR4)信号通路对SAP病生理过程的影响,以及大黄素的治疗效应。分析TLR4信号通路是否可通过影响Treg/Th17平衡,参与SAP发生发展,以及大黄素发挥效应的作用机制,深化对SAP病理生理机制的认识。 方法: 1、TLR4信号通路在SAP病生理机制中的作用:SPF级健康雄性C57/BL小鼠40只,TLR4基因敲除小鼠40只,体重均约20g,随机数字表法随机分为4组(n=20):(1)对照组(Sham组);(2)重症急性胰腺炎模型组(SAP组);(3) TLR4-对照组(TLR4-Sham组);(4) TLR4-重症急性胰腺炎模型组(TLR4-SAP组)。2、大黄素治疗SAP机制研究:SPF级健康雄性C57/BL小鼠60只,体重约20g,随机数字表法随机分为3组(n=20):(1)对照组(Sham组);(2)重症急性胰腺炎模型组(SAP组);(3)大黄素治疗组(Emodin组)。受试动物喂养于室温约为(20-25)℃的动物实验室中,正常饲养一周,实验前禁食18 h,可自由饮水。采用雨蛙素联合脂多糖小鼠腹腔内给药的方法制备小鼠SAP模型。大黄素治疗组于制作SAP模型后经腹腔缓慢注射大黄素2.5mg/kg体重。观察术后48小时内各组小鼠死亡率,断颈处死小鼠,采用全自动生化分析仪检测小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平。HE染色方法检测胰腺组织病理学改变,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平,流式细胞术检测各组小鼠Treg及Th17比例,实时荧光定量PCR方法检测Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA的表达。 结果: 1、TLR4信号通路在SAP病生理机制中的作用 1.1.Sham组及TLR4-Sham组小鼠腹腔注射生理盐水后仅有部分出现活动减少,其余小鼠呼吸平稳,活动及饮水均正常,大便成形,颜色为棕黑色,对外界刺激反应正常。SAP组小鼠在注射雨蛙素及脂多糖后,即出现呼吸频率增快、被毛凌乱且无光泽、活动倦怠、进食水减少、对外界刺激反应淡漠等症状,部分小鼠甚至出现腹泻症状。TLR4-SAP组小鼠造模后表现出活动减少,呼吸增快,饮水正常,被毛略显凌乱但有光泽,对外界刺激反应迟缓,未出现腹泻症状,一般状态较SAP组好转。 1.2.Sham组及TLR4-Sham组48h内小鼠无死亡,死亡率为0%。SAP组12h、24h、48h累积死亡率分别为5%、10%、20%。TLR4-SAP组12h、24h、48h累积死亡率分别为0%、5%、10%。SAP组48h内累积死亡率较Sham组明显升高(P<0.05),而TLR4-SAP组较SAP组明显下降(P<0.05)。 1.3.Sham组及TLR4-Sham组血清脂肪酶、血清淀粉酶水平比较无明显差异(P>0.05)。SAP模型组血清脂肪酶、血清淀粉酶明显高于Sham组(P<0.05),胰腺病理损害明显,组织学评分升高(P<0.05);TLR4-SAP组较SAP组血清脂肪酶、血清淀粉酶均下降(P<0.05),同时胰腺病理损害减轻,组织学评分下降(P<0.05)。 1.4.Sham组及TLR4-Sham组血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平比较无明显差异(P>0.05)。SAP组血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平显著高于Sham组(P<0.05)。而TLR4-SAP组以上血清因子指标较SAP组明显下降(P<0.05)。 1.5.Sham组及TLR4-Sham组比较无明显差异(P>0.05)。与Sham组比较,SAP组Treg及Th17细胞比例均升高(P<0.05),且趋于Th17细胞占优势,故Treg/Th17比值降低(P<0.05),于此同时Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表达均增加(P<0.05)。而TLR4-SAP组Treg及Th17细胞比例较SAP模型组均降低(P<0.05),以Th17细胞尤为显著,所以Treg/Th17比值升高(P<0.05),并且Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表达均下调(P<0.05)。 2、大黄素治疗SAP机制研究 2.1.Sham组小鼠腹腔注射生理盐水后仅有部分出现活动减少,其余小鼠呼吸平稳,活动及饮水均正常,大便成形,颜色为棕黑色,对外界刺激反应正常。SAP组小鼠在注射雨蛙素及脂多糖后,即出现呼吸急促、被毛凌乱且无光泽、活动倦怠、进食水减少、对外界刺激反应淡漠等症状,部分小鼠甚至出现腹泻症状。Emodin组小鼠造模后表现出活动明显减少,呼吸增快,被毛竖立无光泽,对外界刺激反应迟缓,24h后较SAP组小鼠一般状态明显好转。 2.2.Sham组48h内小鼠无死亡,死亡率为0%。SAP组12h、24h、48h累积死亡率分别为5%、10%、20%。Emodin组12h、24h、48h累积死亡率分别为0%、0%、10%。SAP组48h内累积较Sham组明显升高(P<0.05),而Emodin组较SAP组明显下降(P<0.05)。 2.3.SAP模型组血清脂肪酶、血清淀粉酶明显高于Sham组(P<0.05),胰腺病理损害明显,组织学评分升高(P<0.05);Emodin组较SAP组血清脂肪酶、血清淀粉酶均下降(P<0.05),同时胰腺病理损害减轻,组织学评分下降(P<0.05)。 2.4.SAP组血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平高于Sham组(P<0.05)。而Emodin组血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平较SAP组明显降低(P<0.05)。 2.5.SAP组Treg及Th17细胞比例较Sham组均升高(P<0.05),趋于Th17细胞占优势,故Treg/Th17比值降低(P<0.05),于此同时Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表达均增加(P<0.05)。而Emodin组Treg及Th17细胞比值较SAP模型组均降低(P<0.05),以Th17细胞尤为显著,Treg/Th17比值升高(P<0.05),并且Foxp3 mRNA、RORγt mRNA、IL-17mRNA表达减弱(P<0.05)。 结论: 1、SAP病生理过程中Treg与Th17细胞比例及功能活性升高,且以Th17细胞尤为显著,导致Treg/Th17失衡,引发细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10及血清淀粉酶、脂肪酶水平升高,加重了胰腺病理损害,提高了小鼠的死亡率,从而Treg/Th17失衡可能是导致机体免疫平衡紊乱,加重SAP严重程度的重要原因之一。 2、TLR4信号通路可通过影响Treg、Th17细胞比例及功能活性,致使Treg/Th17失衡,参与SAP免疫平衡紊乱的发生发展。 3、大黄素能明显降低细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10及血清淀粉酶、脂肪酶的水平,减轻胰腺病理损害,降低了小鼠的死亡率,同时能够降低Treg及Th17比例及功能活性,调节Treg/Th17平衡,改善机体免疫平衡紊乱,从而达到治疗SAP的效果。