【摘 要】
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背景目前为止,新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球的感染人数已经超过1.5亿人,并造成近330万人死亡。该疾病传播迅速,且仍没有特定的治疗方案,早期诊断以及及时管控是阻止病毒进一步传播的有效方式。目前COVID-19的检测方法主要有病毒基因检测、抗体检测以及抗原检测三种手段,相关方法较多且发展较快,但仍存在成本高、耗时长、敏感度低等一系列问题。因此,急需建立一种检测方法来弥补不足。目的利用新
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背景目前为止,新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球的感染人数已经超过1.5亿人,并造成近330万人死亡。该疾病传播迅速,且仍没有特定的治疗方案,早期诊断以及及时管控是阻止病毒进一步传播的有效方式。目前COVID-19的检测方法主要有病毒基因检测、抗体检测以及抗原检测三种手段,相关方法较多且发展较快,但仍存在成本高、耗时长、敏感度低等一系列问题。因此,急需建立一种检测方法来弥补不足。目的利用新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组N蛋白,采用时间分辨荧光免疫层析技术,建立一种新型的快速评价血清中SARS-CoV-2抗体水平的检测方法,为COVID-19的初步筛查以及辅助诊断提供一种新的技术手段。方法1、重组抗原鉴定:对SARS-CoV-2重组N蛋白（NC）进行SDS-PAGE和Western Blot,检测目的蛋白的表达情况。2、多克隆抗体制备:使用重组蛋白NC免疫新西兰大白兔,对获得的抗血清进行纯化。使用Western Blot鉴定纯化后得到的多克隆抗体,并进行效价测定。同时使用该抗体制备室内参考品。3、SARS-CoV-2抗体荧光免疫层析检测方法的建立:首先对玻璃纤维膜以及硝酸纤维素膜两种原材料进行筛选,优化制备工艺中的偶联时间、活化剂用量、缓冲液p H、蛋白标记量等条件。使用优化后的条件制备试纸条,从cut-off值、精密性、特异性、加速稳定性等方面对其进行性能评价。结果1、通过SDS-PAGE检测,所获目的条带所在位置与NC抗原分子量大小一致;通过Western Blot鉴定,NC抗原能够与SARS-CoV-2 N蛋白（NP）抗体发生特异性结合。2、通过酶联免疫法（ELISA）对纯化后的兔源多克隆抗体进行检测,其效价提升为纯化前效价的四倍。通过Western Blot鉴定,纯化后抗体可正确识别重组抗原NC和天然抗原NP,并成功制备了一系列阳性参考品。3、通过原材料筛选以及工艺优化,最终建立了快速评价血清中SARS-CoV-2抗体水平的方法。该方法所制备的试纸条中FT/FC的cut-off值为0.05,FT的cut-off值为1008,批间以及批内的精密性均符合要求,与肺炎支原体、EB病毒、甲型流感病毒以及乙型流感病毒均未出现交叉反应,在37℃条件下加速破坏21天后稳定性较好。与已上市的试剂盒进行对比,符合率可达97.04%。结论1、确定了重组抗原的特异性,并且其纯度较高,可达99%以上。2、得到了效价较高、特异性良好的多克隆抗体,并建立了一套针对抗体检测的室内质控品。3、初步建立了SARS-CoV-2抗体荧光免疫层析检测方法。
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