研究目的:双相磷酸钙（biphasic calcium phosphate,BCP）（HA/β-TCP）陶瓷是修复骨缺损的较为主要的材料。目前,BCP大多是由人工合成,其制备方法复杂,工艺精细且制作成本高。近年来,由于鱼骨易得且加工工艺简单,较多研究聚焦于鱼骨来源的天然多孔BCP生物陶瓷。本实验以鲑鱼骨为原料,采用高温煅烧法在不同气体中处理鲑鱼骨,旨在制备富含CO₃^2-的BCP生物陶瓷,同时筛选出简单易行的方法,并讨论不同气体下高温煅烧鲑鱼骨产生含CO₃^2-的BCP生物陶瓷的机制。由于BCP生物陶瓷在临床修复骨缺损中的应用逐渐广泛,研究表明其具有良好的骨传导性能但骨诱导特性在文献中仍存在争议,且材料的微观结构对其固有骨诱导性能极为重要。为了探索BCP生物陶瓷其微观结构对骨诱导性能的影响,我们通过对鲑鱼骨来源的含与不含CO₃^2-的BCP生物陶瓷一系列表征,对比两组化学组成、物理结构的差异;进行体外细胞实验对比两组材料的骨诱导性能;并初步分析化学组成和物理结构的微观改变对成骨诱导性能的影响。本研究旨在通过对鱼骨来源的BCP多孔陶瓷支架材料改性,使鱼骨来源的天然多孔BCP生物陶瓷与人骨组织的理化性能更相近、生物相容性更好、骨诱导性能更优。研究方法本实验拟将原材料分组应用石英管式炉煅烧,并对煅烧后的样本行物理结构和化学组成的表征。首先,鲑鱼骨被分为A、B、C、D、E五组。其中A、B、C三组在CO₂气体（1L/min）中煅烧1小时,温度分别为900°C、1000°C、1100°C;D组先在600°C的空气中煅烧1小时,再转入900°C的CO₂气体中煅烧1小时;E组作为对照组未行煅烧。之后,通过X射线衍射仪（XRD）、傅里叶红外光谱仪（FTIR）对上述五组煅烧后的样本进行表征,筛选出含CO₃^2-的BCP生物陶瓷。XRD用于检测材料的结晶度和物相组成,FTIR分析材料的主要特征官能团。为了比较含与不含CO₃^2-的BCP生物陶瓷物理结构、化学组成和生物学性能的差异。首先,鲑鱼骨被分为A、B两组。其中,A组先在空气中经600°C高温煅烧1小时,后在CO₂气体中经900℃高温煅烧1小时;B组按前期实验筛选出方法,先在空气中经600°C高温煅烧1小时,后在空气中经900℃高温煅烧1小时。然后,进行组成和物理结构表征。XRD用于检测两组样本的粉末结晶度和物相组成,后经Rietveld精修完善得出两组材料的晶胞参数,并通过计算密度以反映晶胞原子排布紧密性以及结构规则性;FTIR分析识别样本的主要特征官能团,并在FTIR图谱上通过比较CO₃^2-和PO₄^3-的消光系数（E）估算CO₃^2-含量,同时还可利用碳元素分析仪（CHN）估测;电子扫描电镜（SEM）用于观察两组材料的微观结构和晶体尺寸;此外,电感耦合等离子体发射仪（ICP-OES）用于测定两组材料的Ca/P比和其他微量元素的含量。最后,用体外细胞实验检测生物学性能。先根据国际医疗器械评估标准（ISO标准,10993-12）制备两种材料的提取物,后将提取物分别与人骨髓间充质干细胞（h BMSCs）共培养。CCK-8法检测样本的细胞毒性以及对细胞增殖能力的影响;并行蛋白印迹分析（Western-blot）检测早期成骨相关转录因子Runx2和促进成骨诱导分化通路中特殊蛋白Smad4;此外,茜素红染色用于评估两组样本对h BMSCs成骨诱导分化活性的效应。研究结果经高温处理的四组鱼骨均有改变。肉眼观,A、B两组呈现出黑色且A组颜色更深,表明A、B组有机质未完全除净、故不予检测。而C、D组呈现白垩色。对C、D、E组的表征结果发现:XRD图谱示C、D组都含有HA和β-TCP的特征峰,表明已生成BCP,但E组仅出现HA的特征峰。与标准卡相比,D组图谱上的HA峰发生偏移,且更短、宽;而C组图谱中除了HA和β-TCP衍射峰外,还有其他衍射峰的存在,表明有杂质产生。在FTIR图谱中C、D、E组均可观察到CO₃^2-的吸收峰,但C、E组存在机杂质的吸收峰,这与XRD图谱结果相一致。检测表明含CO₃^2-的BCP生物陶瓷化学组成、物理结构及生物学性能发生变化。在FTIR光谱中A组CO₃^2-的吸收峰明显,根据FTIR图谱可出估算A组CO₃^2-含量为3.74wt%,而B组中无CO₃^2-的吸收峰;CHN分析仪测得CO₃^2-含量A组为3.2 wt%,B组为0.068wt%,接近人骨组织含量的理想范围。XRD图谱中,相比于B组,A组HA的衍射峰短宽且有偏移,提示掺杂物的存在。物相定量分析发现A组中β-TCP的相对含量为45.3wt%,而B组为38.2wt%,Rietveld精修结果示a、b轴晶胞参数B组为9.4845nm,而A组为9.2942nm,示A组的晶胞结构不完整;计算密度B组为3.114 g/cm³,而A组为2.882 g/cm³,示B组晶胞中原子排列更紧密,结构更规则。高倍SEM下可观察到A组晶粒尺寸相较于B组明显较小;压汞仪测得的天然微孔总孔隙率A组64.06%、B组为49.6%;比表面积A组为17.161m²/g、B组为5.829 m²/g。体外细胞实验表明两组材料无细胞毒性,且对h BMSCs有促增殖作用,其中A组样本的作用更明显;WB结果提示:相比B组,经A组样本培养的细胞中Runx2表达增加,Smad4表达也增强;茜素红染色显示:A组含有较多簇状红色钙化结节。结论:1、通过改进制备方法可以利用鲑鱼骨生成含CO₃^2-的BCP生物陶瓷并去除其中的有机质;2、其方法为将鲑鱼骨先后在600℃的空气中和900℃的CO₂气体中各煅烧1小时。3、含CO₃^2-的BCP生物陶瓷中,β-TCP相对含量增多、晶粒尺寸减小、结晶度降低、总孔隙率增加和比表面积增大;4、含CO₃^2-的BCP生物陶瓷生物相容性更好,骨诱导性能更优。